蘇召維 王永東 劉 聰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)展

蘇召維 王永東 劉 聰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

MSCs是具多向分化與自我復(fù)制能力的干細(xì)胞，能夠分化成為多種類型的組織細(xì)胞。相比于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，MSCs成本較低、來源充足、對捐獻(xiàn)者不構(gòu)成病毒或細(xì)菌感染，在未來的臨床應(yīng)用中展現(xiàn)了較好的發(fā)展與應(yīng)用潛力。該文對骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行分析。

骨組織工程;臍帶;間充質(zhì)干細(xì)胞

骨折及骨科疾病是臨床中較為常見的病癥，為患者帶來了一定身體痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床中針對骨折與骨科疾病的治療，主要采用自體移植、人工植入及異體移植等，但上述方式均存在一定缺陷。MSCs具強(qiáng)大的多向分化功能，能夠誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞，幫助提升骨折或骨科疾病的治療效果。在此背景下，對骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行分析具一定現(xiàn)實(shí)意義。

1 MSCs的分離與培養(yǎng)

1.1 MSCs的分離

吉林大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院的楊晨[1]對MSCs的分離進(jìn)行了研究，首先在手術(shù)室收集得到足月分娩的、健康的、新鮮的胎兒臍帶，將其放于融入了濃度為0.1%雙抗的氯化鈉溶液中，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對臍帶進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞分離。其次，將臍帶取出，浸泡于酒精內(nèi)約5 min，后以碘酒進(jìn)行充分擦拭消毒，置于氯化鈉溶液下反復(fù)清洗，直至外圍血塊完全沖掉。將臍帶剪至2 cm/段的大小，以鑷子固定住臍帶邊緣，用剪刀小心剔除臍帶外膜，將內(nèi)含的華氏膠組織分離出來。取膠完成后接著剔除臍帶內(nèi)的血管，再次以氯化鈉溶液沖洗，或直接在融入了濃度為0.1%雙抗的氯化鈉溶液中進(jìn)行，以保證操作的無菌性。

1.2 MSCs的培養(yǎng)

武漢大學(xué)中南醫(yī)院的胡培[2]等人對MSCs的分離、培養(yǎng)進(jìn)行了研究，其MSCs分離操作與楊晨基本相同，華氏膠組織成功分離后，將其放入α-MEM培養(yǎng)液（內(nèi)涵100 U/mL鏈霉素與青霉素、10%胎牛血清）中，在CO2濃度為5%、箱內(nèi)溫度為37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的李鐸[3]選擇將切成管狀的臍帶繼續(xù)切片，再將片狀臍帶組織切割致2～3 mm3，利用吸管逐一將碎狀臍帶組織植入T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶已預(yù)先由D/F12培養(yǎng)基（內(nèi)含有濃度為20%的FBS）包被完成，植入密度為每瓶20～25塊碎狀臍帶組織；再將培養(yǎng)瓶置于溫度為37℃，CO2濃度為5%的溫箱中，定時(shí)向箱內(nèi)補(bǔ)充培養(yǎng)基（1 mL/d），每隔3 d全量換液。

哈爾濱第五醫(yī)院手外科分院的聶廣辰[4]等人對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線的繪制進(jìn)行了研究，在細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)將其分別種植于6孔板的其中4孔中持續(xù)培養(yǎng)8 d，按MTT法對細(xì)胞的增值情況進(jìn)行測定，當(dāng)細(xì)胞增值密度飽和，細(xì)胞進(jìn)入平頂期時(shí)停測。卓峰等人[5]在細(xì)胞增殖特定于曲線繪制的研究中提出，現(xiàn)階段培養(yǎng)MSCs普遍采用的方法包括酶消化法與培養(yǎng)法，對MSCs細(xì)胞進(jìn)行初代培養(yǎng)，該過程消耗約2 w，當(dāng)細(xì)胞融合率致80%時(shí)開始傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞種植2～4 d時(shí)增殖趨勢最盛，傳至第15代時(shí)增殖速度開始減慢，至20代時(shí)增殖基本結(jié)束。早期的細(xì)胞增殖的潛伏期在植入后的36 h內(nèi)，之后開始了成對增長（5～6 d），增殖密度達(dá)到飽和后進(jìn)入到平頂期，綜上可知細(xì)胞增殖曲線呈“S”型。

2 MSCs的特征

2.1 細(xì)胞形態(tài)與生長特征

第二軍醫(yī)大學(xué)的胡凱猛[6]在顯微鏡下對MSCs的形態(tài)進(jìn)行觀察，按貼塊法獲取初代細(xì)胞后對其進(jìn)行種植，4～5 d后即可在貼塊下方觀察到沿瓶底生長的hUMSCs，種植7 d后能夠觀察到細(xì)胞數(shù)量不斷增多，主要呈小梭形及小三角形，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞漸成集落狀生長，且生長狀態(tài)較為均衡，邊界清晰，伴有生長暈。酶消化法培養(yǎng)下初代細(xì)胞生長速度較培養(yǎng)法快，通常2～3 d后即在瓶底出現(xiàn)細(xì)胞，7 d后由小梭形及小三角形變?yōu)槎嘟切巍⒓忓N形，且生長迅速，集落生長呈緊靠型。14～15 d后達(dá)到約85%的融合。MSCs胞漿較少，小梭形的形態(tài)較為顯著，細(xì)胞核周的顆粒物質(zhì)較少，消化傳代完成后細(xì)胞解除集落樣生長，且分布均勻。

2.2 細(xì)胞免疫學(xué)特征

呂鵬飛等人[7]在關(guān)于細(xì)胞免疫學(xué)特征的研究中提出，MSCs的免疫學(xué)優(yōu)勢顯著，主要表現(xiàn)在其可以脫離免疫抑制作用而沖破MHC屏障，將細(xì)胞植入遠(yuǎn)交動(dòng)物體內(nèi)。在UCMSC的免疫學(xué)特征分析中，證實(shí)其對人外周血單核細(xì)胞、鼠脾細(xì)胞及純化T細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有抑制作用，從而減緩其增殖速度。毛希宏[8]的相關(guān)研究證明MSCs表面的抗原存在非專一性，主要包括細(xì)胞因子與生長因子受體類、粘附分子類、整和素家族成員類與其他分子類等四大類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UCMSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的陽性率超過90%，而CD134、CD45、CD11b則為陰性，在23代內(nèi)的傳代培養(yǎng)中，各類細(xì)胞因子無明顯差異，證明UCMSCs在經(jīng)過多代培養(yǎng)之后免疫學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。

2.3 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化特征

hUCMSC的誘導(dǎo)分化能力較強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)多向分化，包括內(nèi)胚層、中胚層與外胚層。在張亞斌等人[9]的細(xì)胞誘導(dǎo)分化體內(nèi)研究中，證實(shí)hUCMSC能夠分化成為內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，而在細(xì)胞誘導(dǎo)分化體外研究中，還發(fā)現(xiàn)hUCMSC可分化為成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞、生殖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，在研究hUCMSC分化成為成骨細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)過程中hUCMSC的ALP活性提升，且鈣結(jié)節(jié)與鈣沉積現(xiàn)象明顯，證明其具成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)潛能。上述研究結(jié)果表明，hUCMSC誘導(dǎo)分化功能強(qiáng)大，在臨床中的應(yīng)用價(jià)值與應(yīng)用范圍明顯優(yōu)于造血干細(xì)胞。

3 討論

骨組織工程是近年來臨床新興的學(xué)科，其中胚胎干細(xì)胞作為骨組織工程研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)，受到了臨床醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。通過上述研究可知，MSCs分化潛能較高，在軟骨、成骨、韌帶、肌腱、肌肉、神經(jīng)、心肌、肝等組織中均具誘導(dǎo)分化潛能，臨床應(yīng)用前景廣闊。李素萍等人[10]相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下，MSCs能夠沿培養(yǎng)瓶進(jìn)行增值，可以表達(dá)CD44、CD105及CD90，但不能表達(dá)HLA-DR、CD34及CD45，在體外培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化潛能。

在此背景下通過改進(jìn)現(xiàn)有MSCs誘導(dǎo)分化為成骨或軟成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方式，或在已知干細(xì)胞的基礎(chǔ)上找尋新型干細(xì)胞，以提升胚胎細(xì)胞在骨組織工程研究中的合適度，成為目前國內(nèi)外相關(guān)研究的探索目標(biāo)。在現(xiàn)代生物科技快速發(fā)展的時(shí)代背景下，學(xué)者們一定可以尋找到理想的培養(yǎng)途徑或干細(xì)胞類型，不斷推動(dòng)骨組織工程的發(fā)展前進(jìn)。

[1]楊晨.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定[D].長春：吉林大學(xué),2013:9-11.

[2]胡培.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].生物技術(shù)通訊,2014,25 (1):87-90.

[3]李鐸.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2011:14-22.

[4]聶廣辰.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向成骨細(xì)胞分化的研究[J].中國傷殘醫(yī)學(xué),2014,22(6):48-52.

[5]卓鋒.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國矯形外科雜志,2012,20 (1):49-51.

[6]胡凱猛.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向造血細(xì)胞方向分化的研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2012:21-23.

[7]呂鵬飛,張光武.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織工程中的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013,7(10):4433-4435.

[8]毛希宏.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及其向神經(jīng)元細(xì)胞分化的研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(1):41-47.

[9]張亞斌,解莉楠.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].生物技術(shù)通訊,2013,24(3):437-438.

[10]李素萍.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞低溫凍存后生物學(xué)鑒定[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2012,14(4):289-294.

The Application of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering

SU ZhaoweiWANG Yongdong LIU Cong
Inner Mongolia medical university,Hohhot,Inner Mongolia，010058，China

MSCs is multi-directional differentiation and replicate ability of stem cells,It can differentiate into multiple types of cells.Compared with bone marrow mesenchymal stem cells and adipose mesenchymal stem cells,The source of MSCs was sufficient and cost was low,and it does not infect to the donor,It's clinical application shows the good development and potential applications in future.In this paper,The application were reviewed on Umbilical cord mesenchymal stem cells in bone tissue engineering.

Bone tissue engineering;The umbilical cord;Mesenchymal stem cells

R329

A

1674-0742（2014）10（c）－0195-02

2014-08-16)

蘇召維（1972.11-），男，內(nèi)蒙呼和浩特人，碩士在讀，研究方向：主治醫(yī)師，骨科急診醫(yī)學(xué)。