王金花，郜海燕，許晴晴，穆宏磊，葛林梅，宋麗麗*

（1.浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江杭州 310021；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

轉錄組學在果蔬采后衰老生物學中的研究進展

王金花1，2，郜海燕1，許晴晴1，2，穆宏磊1，葛林梅1，宋麗麗1*

（1.浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江杭州 310021；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

采后衰老是制約果蔬貯藏保鮮的重要因素。利用轉錄組學技術，可以從轉錄組水平上揭示果蔬成熟衰老的分子機理。本文綜述了主要的轉錄組學平臺的技術特點、方法以及轉錄組學在果蔬采后研究中的應用現(xiàn)狀，重點介紹了轉錄組學在番茄、桃、西藍花和越橘等果蔬采后衰老生物學研究中的進展，分析了目前應用中存在的問題，并展望了轉錄組學在果蔬采后生物學研究中的發(fā)展前景。

轉錄組學；果蔬；衰老；貯藏保鮮

果蔬采收后極易衰老、腐爛，品質下降很快，成為限制果蔬產業(yè)發(fā)展的重要因素。據(jù)統(tǒng)計，我國每年有20%～40%的新鮮果蔬產品在采后腐爛，據(jù)估計經(jīng)濟損失超過1000億元［1］。利用轉錄組學和蛋白質組學技術手段深入揭示果實成熟衰老的本質，有助于今后通過人工方法調控果蔬產品采后的衰老過程，從而延長果蔬保鮮期。迄今為止，已有50多篇涉及果蔬采后衰老過程的轉錄組學研究文章發(fā)表，這些研究從番茄［2-3］、西蘭花［4］、桃［5］、越橘［6］等果蔬中鑒定了大量的衰老相關基因，加深了人們對果蔬衰老的認識。隨著RNA高通量測序技術［7］在轉錄組學上的應用和發(fā)展，果蔬采后分子生物學的研究將迎來新的機遇。

1 轉錄組學的定義及其研究意義

轉錄組學由Velculescu等［8］于1997年首次提出。目前轉錄組的定義可分為廣義和狹義2種，廣義的轉錄組是指某一生理狀態(tài)下，細胞內所有轉錄產物的集合；狹義的轉錄組是指所有的mRNA集合［9］。作為一種整體的研究方法，轉錄組學不再遵循單個基因的研究模式，而是將分子生物學的研究帶入了一個高速發(fā)展的時代［10］。

轉錄組的研究具有重要意義。首先，轉錄組是連接基因組的遺傳信息與蛋白質的紐帶，轉錄組水平的信息調控是目前已知的最重要也最為廣泛的生物調節(jié)方式之一［11］。其次，轉錄組與基因組不同，基因組具有靜態(tài)實體的特點，而轉錄組同時受內源和外源因子的調控，是物種特有的基因組和外部物理特征（如采后果實1-MCP熏蒸、氣調處理等）的動態(tài)聯(lián)系。轉錄組反映的是生物的特定器官、組織在特定的發(fā)育、生理狀態(tài)下所有基因的表達水平，因此，可以用轉錄組來比較不同組織或不同生理條件下基因水平的表達差異，從而研究生理功能相關的基因［12］。再者，作為一種整體的研究方法，轉錄組可以提供特定狀態(tài)下特定細胞、組織的全部表達信息，再與生物體的基因組對比，從而推測一些未知基因的功能，并進一步揭示其調節(jié)因子的作用機制。李瀅等［13］利用454測序技術對西洋參的根組織進行轉錄組測序，并通過real-timePCR等實驗對測序結果進行組織特異性表達分析驗證，確定了與人參皂苷合成途徑最相關的1個P450基因與4個UDP基因。

2 轉錄組學研究的主要技術方法及其原理

轉錄組學的研究技術主要可分為4類：基于雜交技術的DNA微陣列（DNAmicroarray）技術和DNA宏陣列（DNAmacroarray）技術，基于PCR技術的cDNA擴增限制性片段長度多態(tài)性技術（cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism，cDNA-AFLP），基于標簽的基因表達系列分析技術（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）和大規(guī)模平行測序技術（massivelyparallelsignature sequencing，MPSS），以及基于直接測序的高通量RNA測序（RNA-sequencing，RNA-Seq）。

2.1 基于雜交的轉錄組技術

DNA微陣列，又稱為DNA芯片，采用寡核苷酸原位合成等手段，將數(shù)以萬計的cDNA、ESTs等DNA片段有序地固定在硅片、玻璃等表面，從而產生DNA探針陣列，然后與帶有熒光或同位素標記的生物樣品進行雜交，通過激光共聚焦顯微鏡檢測雜交信號，依據(jù)探針位置、序列及雜交信號強弱來分析待檢測基因的表達情況［14］?；蛐酒捎糜诎l(fā)現(xiàn)新基因，進行基因的表達情況分析及快速檢測轉基因植株等方面。Maruyama等［15］利用基因芯片技術對冷脅迫條件下轉基因擬南芥過表達的轉錄因子DREB1A下游基因表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)38個基因，其中20個屬未知基因，并且這些基因所編碼的蛋白大部分都具有抗脅迫功能。Darrigues等［16］基于公共數(shù)據(jù)庫中的ESTs序列開發(fā)SNP標記，制備芯片與目標cDNA雜交，發(fā)現(xiàn)1296個潛在SNP位點中有99個可用于分子標記檢測番茄顏色、營養(yǎng)相關的基因表達。

DNA宏陣列的技術原理及流程和DNA微陣列相似，不同點在于，DNA宏陣列技術是將基因片段以低密度固定在尼龍膜上，形成DNA宏陣列。其中由于DNA片段的低密度特征，DNA宏陣列技術的檢測量明顯低于DNA微陣列技術。但其不受儀器條件的制約，在普通實驗室即可進行操作。將DNA操作技術與抑制性消減雜交技術結合，可以用來篩選和鑒定差異基因。

2.2 基于PCR技術的cDNA擴增限制性片段長度多態(tài)性技術

cDNA-AFLP是將RT-PCR和AFLP技術結合的一種技術。主要用來分析基因轉錄水平的表達差異［17］。其技術原理為，提取RNA后，在逆轉錄酶的作用下經(jīng)反轉錄合成1條cDNA，合成的cDNARNA雜交體系中的RNA被RNA酶H切割，形成切開和缺口，RNA片段就作為引物在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第2條鏈，缺口被連接酶封閉。然后用特定的2種限制性酶酶切，酶切后加上人工接頭，再用引物進行預擴增和選擇性擴增，最后利用大型聚丙烯酰胺凝膠電泳來顯示具有差異性的轉錄產物。cDNA-AFLP具有可以全面獲取轉錄組的表達信息［18-19］，重復性好、假陽性低［20-21］，幾乎所有的表達基因都可用其檢測，能準確反映基因之間表達量的差別等優(yōu)點。雖然cDNA-AFLP是研究基因表達模式的有效工具，但其在應用中也存在一定的局限性。一方面，并不是所有的轉錄片段都具有2個限制性內切酶的識別位點，因此通過cDNA-AFLP技術獲得的表達序列不全面。另一方面，cDNA-AFLP技術流程比較繁瑣，耗時較長，且熒光標記引物顯示技術費用較高。

2.3 基于標簽的基因表達系列分析技術和大規(guī)模

平行測序技術

SAGE和MPSS是基于Sanger測序法的一種定量高通量基因表達分析技術。SAGE最初由Wiiiliams［22］在1995年研究酵母基因組基因中首次提出并運用。SAGE是用轉錄本3′末端特定位置的單一序列作為序列標簽，利用酶切分離轉錄本的序列標簽，接著再將這些序列連接，最后對連接體進行克隆和測序，根據(jù)序列標簽的出現(xiàn)次數(shù)來估計基因的表達量。由于每個測序克隆中都含有幾十個特定的序列標簽，因此SAGE的單位測序成本獲得的信息量高，其中大多數(shù)為低豐度的轉錄本［23］。因此，SAGE可用于尋找一些低豐度的轉錄物，從而最大限度地收集基因組的基因表達信息。SAGE還可用于定量比較特定狀態(tài)下的基因表達，尋找新基因［24-25］。但SAGE文庫的構建技術要求高，技術流程比較復雜，需要的樣本量多，同時由于單條特定短序列標簽所攜帶的基因信息少，不適宜一些遺傳信息缺乏的生物體的轉錄組研究。Poroyko等［26］利用SAGE技術研究了玉米根的轉錄譜，從SAGE標簽中檢測到14850個基因的表達，其中47%都不能從現(xiàn)有的cDNA或基因數(shù)據(jù)庫中找到，體現(xiàn)了SAGE技術具有良好的發(fā)現(xiàn)新基因的能力和分析基因表達的能力。Chakravarthy等［27］用SAGE技術對擬南芥和番茄中基因的表達情況進行比較，發(fā)現(xiàn)了其中轉錄因子Pti4調控了50個與防御相關基因的表達，且表達豐度較高。

MPSS是Brenner等［28］于2000年創(chuàng)建，并由美國lynex公司將其商品化的一種測序技術。MPSS是對SAGE的改進，能在較短的時間內檢測出特定細胞或組織內在特定狀態(tài)下全部基因的表達情況，是功能基因組研究的有效工具。其技術原理是一個特定標簽序列含有能夠特異性識別轉錄子的信息，當標簽序列連接到長的連續(xù)分子上后，就可以通過序列標簽在樣品中的拷貝數(shù)來計算該標簽序列相對應的基因表達水平。MPSS技術能測定出樣本中幾乎所有表達的基因，且無需事先知道基因序列，因此適用于所有生物體。然而該技術和基因芯片技術一樣，需要昂貴的硬件和配套軟件協(xié)同運作［29］。

2.4 高通量RNA測序

Sanger測序是以末端終止法為核心的一種化學測序法，是傳統(tǒng)的一代測序法的基礎。通過不斷地探索和改良，作為更加快速、準確性更高、并且成本更低的新一代高通量測序技術被成功開發(fā)［30-31］。研究人員將高通量測序技術應用于轉錄組分析，繼而開發(fā)出RNA測序技術，使能夠在全基因組范圍內檢測基因表達情況，進行差異基因篩選分析。

在開展RNA-Seq時，需首先獲得細胞總RNA，根據(jù)實驗需要，對RNA樣品進行處理。處理好的RNA再進行片段化，反轉錄形成cDNA，獲得cDNA文庫，然后在cDNA片段的兩端接上接頭，最后用新一代高通量測序技術依次進行測序。Li等［32］利用高通量轉錄組測序技術對玉米葉片轉錄組進行研究發(fā)現(xiàn)，在玉米的不同發(fā)育階段約有64%的基因發(fā)生了差異性表達。郝大程等［33］對中藥植物虎杖的根進行了solexa高通量轉錄組測序，對所得短讀序列進行組裝注釋，得到86418個unigene，其中參與甲羥戊酸生物合成的有12個，參與莽草酸的生物合成的有60個，參與白蔡蘆醇合成的有54個。這些基因都可能參與了藥用活性物質的生物合成，為進一步利用基因工程的手段提高虎杖有效成分的含量奠定基礎。

RNA-Seq具有以下優(yōu)點：第一，通量更高。運用第2代測序平臺可得到幾個到幾百億個堿基序列，因此可以達到覆蓋整個轉錄組的要求。第二，數(shù)字化信號。直接測定每個轉錄本片段序列，單核苷酸分辨率的精確度，同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題。第三，不受物種限制。RNA-Seq技術無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進行轉錄組分析。可用于檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉錄本，并精確地識別可變剪切位點及cSNP、UTR區(qū)域。第四，高靈敏度。能夠檢測到細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本。由于RNA-seq相對于傳統(tǒng)的測序方法具有明顯的優(yōu)勢，所以被廣泛運用到差異基因表達分析、新轉錄本發(fā)現(xiàn)、可變剪切研究等方面［8］。并且隨著技術進步，成本不斷降低，其應用也越來越廣泛。近年來，對于測序結果進行分析的軟件也越來越豐富，RNA-seq技術將會獲得更大的普及。

3 轉錄組學在果蔬采后衰老研究中的應用

轉錄組在果蔬采后研究上的應用主要體現(xiàn)在對果蔬基因轉錄組水平的研究，包括不同樣本間的基因差異表達、基因表達量等。將轉錄組學應用到果蔬采后研究主要有以下幾個目的：第一，建立采后果蔬不同時期轉錄組學的RNA指紋圖譜，闡明果蔬采后衰老的分子調控機制。第二，通過特定的表達圖譜對果蔬組織貯藏特定階段或經(jīng)過特殊處理的基因表達情況進行對比，進而為研究果蔬采后保鮮機理及篩選保鮮方式奠定基礎。第三，對已知的基因功能進行注釋，發(fā)現(xiàn)新基因，篩選參與果蔬采后代謝合成途徑的基因，探究果蔬中重要的營養(yǎng)或功能物質的合成機制。

3.1 果蔬采后衰老的分子調控機制研究

采后衰老是制約果蔬貯藏保鮮的重要因素，果蔬采后雖然已脫離母體，但仍是一個有生命的生物體，會經(jīng)歷一系列生理變化。了解采后衰老變化對果蔬貯藏保鮮新技術的開發(fā)以及延長的貯藏保鮮期非常重要。目前，果蔬采后衰老的研究大多停留在呼吸生理、化學物質代謝等生理生化水平上，而果蔬采后的成熟、衰老涉及一系列基因的表達與調控。通過轉錄組學的研究技術，可以建立采后果蔬不同時期轉錄組學的RNA指紋圖譜，闡明果蔬采后生理的分子調控機制，為探究各種保鮮方式的保鮮機理、篩選耐貯藏果實以及利用生物工程技術開發(fā)耐貯藏果蔬等提供理論基礎。

Trainotti等［5］為了整體研究果實成熟過程中呼吸躍變過程，用桃的基因芯片μPEACH1.0來分析其基因的表達情況。微陣列雜交表明，在桃果實呼吸躍變這一過程中，有267個基因上調，109個基因發(fā)生下調。考慮到細胞定位，其中顯著上調和下調的基因產物分別屬于細胞壁和葉綠體物質。根據(jù)分子功能和生物過程進行分類，上調最明顯的基因是編碼參與乙烯合成的轉錄因子和酶的基因。Hunter等［4］用微陣列分析技術研究了采后西蘭花處于失水脅迫下其基因表達的情況。用擬南芥的基因組進行跨物種微陣列分析，發(fā)現(xiàn)西蘭花組織采后0～48h內有431個基因的表達發(fā)生改變。試驗表明，采后組織中糖代謝和失水脅迫分子水平并不是簡單的累加效應，而是表現(xiàn)出一種可能的交互作用。

3.2 采后果蔬經(jīng)特殊處理后基因表達情況分析

生物個體具有基因差異表達的個性，即基因的表達不僅受生物體內在機制的調控，也受外界環(huán)境因素的影響，表現(xiàn)為生物個體的不同階段、不同組織、不同條件和不同生理狀態(tài)下，基因表達不同。轉錄組代表細胞或組織內全部的RNA轉錄本，不僅可以反映不同生命階段、不同組織類型及不同生理狀態(tài)的基因表達，還可以顯示不同環(huán)境、不同處理條件下表達的基因。果蔬采后保鮮方法是通過改變果蔬外界環(huán)境因素，如貯藏溫度、保鮮劑作用、氣調、輻照等，來保持果蔬采后品質，延緩衰老進程。果蔬采后不同的保鮮處理伴隨著不同基因的選擇性開啟和關閉，不同基因的上調和下調。利用轉錄組學技術可以有效地分析果蔬不同處理間的基因表達差異，深入掌握保鮮方式的作用機理。利用EST技術構建并分析冷藏與正常成熟桃果實轉錄圖譜，發(fā)現(xiàn)197個重疊群中至少有1個在轉錄水平上存在顯著差異，基因表達圖譜進一步指出這197個重疊群可以分為13組，各組在2種采后貯藏狀態(tài)下轉錄水平各有差異［34］。Crifò等［35］用抑制性消減雜交對低溫放置的紅橙進行轉錄組分析，轉錄水平表達量增強的基因主要涉及細胞氧化損傷、滲透調節(jié)過程及脂類去飽和相關的防御機制，一些參與初級、次級代謝過程的ESTs表達量也增大。研究還表明，低溫能誘導黃酮類物質合成的增加，包括花色苷和代謝過程中供體的合成。利用轉錄組學方法探究桃低溫貯藏過程中香味物質及基因表達的變化發(fā)現(xiàn)，果實遇到冷害后芳香類物質減少是由基因PpLOX1，PpLOX3和PpAAT1表達發(fā)生改變造成的［36］。短波紫外線照射番茄后，用Affymetrix基因芯片技術分析其基因表達圖譜的情況，結果表明，5077個基因發(fā)生變化，2529個基因上調，2548個基因下調。其中上調基因包括信號轉導、細胞壁代謝相關基因等，下調基因包括初級代謝及乙烯相關基因等，這為研究揭示采后短波紫外線照射番茄如何誘導其抗性反應，從而抑制乙烯合成，進而延長番茄的采后貨架期的分子機制奠定了基礎［2］。Mayuoni等［37］利用Affymetrix的柑橘基因芯片對柑橘果肉全基因轉錄圖譜進行分析，以探究乙烯對果肉的影響，結果表明，乙烯會加速與糖代謝、氨基酸代謝、次級代謝及生長激素代謝相關基因的表達。

3.3 分離果蔬采后特定的表達基因

隨著現(xiàn)代分子生物學技術在果蔬研究中的廣泛應用，越來越多的果蔬性狀被標記，一些重要的營養(yǎng)、功能成分的合成途徑也得到深入研究，其中，轉錄組學研究技術發(fā)揮了重要作用。利用該技術，可以從果蔬中篩選到一些與營養(yǎng)、功能成分合成相關的基因，未來有望通過改造這些成分合成途徑中重要基因的活性來調控其含量。

李曉艷等［6］采用高通量測序技術研究越橘果實轉錄組，篩選出92條可能編碼參與黃酮類化合物合成的14個酶的DEGs，克隆出花色素合酶的基因序列，為進一步研究花色苷的合成途徑及調控機制奠定了基礎。李瀅等［13］利用454高通量測序技術對丹參進行轉錄組測序，通過分析其基因表達圖譜，挖掘功能基因，獲得46722個EST，與數(shù)據(jù)庫序列合并拼接后，獲得18235條unigene，其中27條序列可能參與丹參酮的合成，29條可能參與丹酚酸的合成。王曉光等［3］將均一化的mRNA反轉錄獲得cDNA，然后通過與載體重組、轉化等過程建立均一化cDNA沉默文庫，通過一系列的篩選成功獲得了番茄紅素合成相關的PDS基因。

4 問題與展望

4.1 果蔬采后衰老轉錄組學研究存在的主要問題

雖在果蔬采后生理生化、保鮮方法等方面已開展了廣泛的研究，但深入到分子水平的研究卻比較少，特別是對于一些基因組學起步較晚的果蔬，遺傳信息比較薄弱，基因組背景研究幾近空白。因此，如何為果蔬采后衰老研究建立一套完整的研究思路，加快果蔬采后分子水平的深入研究是當前果蔬采后研究面臨的重要問題。

新一代測序技術的發(fā)展為果蔬采后轉錄組學研究提供了新的技術手段，但目前在實際應用中仍面臨2個重要問題。一是生物信息學分析十分復雜，特別是對于缺少參考基因組信息的果蔬，不能進行測序讀段的基因組定位及基因注釋，解讀和分析測序產生的龐大數(shù)據(jù)量比較困難，需要借助一系列的生物信息學手段來解讀這些數(shù)據(jù)，這些海量的生物信息數(shù)據(jù)也為生物信息學帶來了很大挑戰(zhàn)。二是高通量測序依賴于非常昂貴的測序設備，轉錄組測序成本很高。同時，轉錄組學也有其自身的局限性。轉錄豐度與基因的轉錄產物含量或者其活性之間沒有必然的關聯(lián)，因此應慎重用轉錄組學的數(shù)據(jù)解釋果蔬采后生物學。最好結合轉錄組學與蛋白質組學的研究結果來分析果蔬采后的生物變化。

4.2 前景展望

果蔬采后衰老分子生物學的進步依賴于技術的進步?，F(xiàn)代生物技術的發(fā)展，特別是新一代高通量測序等轉錄組研究方法的廣泛應用，必將對果蔬采后分子生物學的發(fā)展帶來新的契機。此外，轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學的結合將會進一步推動果蔬采后衰老分子機制研究的深入。

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（責任編輯：高 峻）

S609文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）07-1067-05

文獻著錄格式：王金花，郜海燕，許晴晴，等.轉錄組學在果蔬采后衰老生物學的中的研究進展［J］.浙江農業(yè)科學，2014（7）：1067-1072.

2014-03-11

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2013CB127103）

王金花（1989-），女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向為農產品加工與綜合利用。E-mail：kekajinzi@163.com。

宋麗麗。