宋春紅，李 芳，郭英慧，張惠云

（山東中醫(yī)藥大學1.實驗動物中心，2.基礎醫(yī)學院，3.科技處，山東 濟南 250355；4.北京豐臺婦幼保健醫(yī)院藥劑科，北京 100069）

CACNA1C基因編碼L型鈣通道α1C亞基，其基因多態(tài)性與多種情感障礙類疾病如精神分裂癥和重度抑郁等發(fā)生有關［1］。經(jīng)前期綜合征（premenstrual syndrome，PMS）發(fā)生的易感神經(jīng)生物學因子與重度抑郁癥相似［2］，該基因與 PMS的關系如何？尚未見報道。因此，本研究從PMS肝氣郁證入手，以舒郁膠囊及主要組份進行藥物干預，采用Western blot和全細胞膜片鉗技術，探索CACNA1C與PMS肝氣郁證的關系和舒郁膠囊的干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，體質量140-160 g，♀，Wistar新生鼠，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［生產(chǎn)許可證號 SCXK（魯）2011-0003］。

1.2 藥品與主要試劑 舒郁膠囊、柴胡提取物和白芍提取物（青島陽光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號：2011L06107、20110526和20110527）；氟西?。ǘY來蘇州制藥有限公司，批號H20050463）；尼莫地平（德國拜爾醫(yī)藥保健有限公司：北京，批號：H20003010）。CACNA1C一抗（ab58552，abcam）；山羊抗兔二抗（SB200，遠達晶美）。

1．3 PMS肝氣郁證大鼠模型復制及給藥 利用慢性束縛應激法制備模型［3］，根據(jù)曠場實驗基線期數(shù)據(jù)將大鼠分為6組，每組10只，分別為正常對照組（生理鹽水，5 ml·kg-1）、PMS肝氣郁證模型組（生理鹽水，5ml·kg-1）、舒郁膠囊組（0.41 g·kg-1）、柴胡提取物組（0.32 g·kg-1）、白芍提取物組（0.036 g·kg-1）、氟西汀 +尼莫地平組（2.7 mg·kg-1）。給藥與人當量，每天灌胃1次。連續(xù)5 d。造模完成后，分離血清并迅速剝離海馬備用。

1．4 Western blot檢測CACNA1C蛋白表達 按 RIPA方法提取海馬腦區(qū)總蛋白。以50μg總蛋白每泳道上樣，SDSPAGE電泳分離蛋白，ECL化學發(fā)光試劑檢測雜交信號，用掃描儀對X光片進行灰度掃描，采用Image J軟件對圖像進行灰密度分析。

1.5 全細胞膜片鉗實驗 各組大鼠血清孵育原代大鼠海馬神經(jīng)元，利用全細胞膜片鉗技術檢測L型鈣通道電流密度（由北京愛思益普生物科技股份有限公司提供技術服務）。

1.6 數(shù)據(jù)分析 利用GraphPad Prism 5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA分析。

2 結果

2．1 PMS肝氣郁證大鼠海馬中CACNA1C蛋白的表達量與正常組相比，各組大鼠海馬中蛋白表達量差別無顯著性（P＞0.05）。

2．2 各組海馬神經(jīng)元細胞L型鈣通道鈣電流密度 與正常組相比，模型組大鼠血清孵育后細胞內(nèi)L型鈣電流密度明顯升高（P＜0.05），各給藥組大鼠血清孵育的細胞L型鈣電流密度差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討論

本研究從CACNA1C蛋白表達和功能兩個方面對其與PMS肝氣郁證的關系進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)CACNA1C蛋白在各組大鼠海馬中表達差異無顯著性，但是模型組大鼠血清孵育的海馬神經(jīng)元L型鈣電流密度明顯升高，藥物干預組大鼠血清孵育的海馬神經(jīng)元差別無顯著性。有研究發(fā)現(xiàn)，CACNA1C雜合基因敲除小鼠可以改變抑郁狀的表型，同時L型鈣通道蛋白表達水平降低和LTCC通道電流減少［4］。但是本實驗沒有在蛋白水平發(fā)現(xiàn)表達差異，很可能與模型復制所需時間短有關；而體外試驗結果表明LTCC通道電流增加可能與PMS肝氣郁證的發(fā)生有關。雌激素和芍藥苷均可阻斷L型鈣通道［6-7］，柴胡皂苷d有類似雌激素的作用，因此我們推測舒郁膠囊和其主要組分柴胡和白芍提取物可能作為L型鈣通道的拮抗劑，但是對其具體作用微觀機制我們還將進一步證實和深入研究。

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