葛志華 李俊玫 于海忠 孫立新 楊 寧 楊佳寧 李俊穎

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

端粒酶學說是目前比較公認的細胞衰老分子機制的主流學說之一。該學說認為端粒是真核細胞染色體末端的DNA重復序列，對染色體的穩(wěn)定和DNA完整復制起重要作用。通常認為當染色體端粒DNA因分裂而縮短到臨界長度時，細胞的內(nèi)在機制發(fā)生作用而不能再分裂，進入衰老。而端粒結(jié)構(gòu)是由活性端粒酶來維持的〔1～3〕。因此，端粒酶再激活被認為是細胞逃脫衰老的重要機制。以往的衰老研究，一般多集中在心、肝、腦、肺、腎、生殖器等重要的臟器，而關(guān)于下頜下腺組織增齡性改變的研究資料少之又少。下頜下腺是分泌功能旺盛的腺體，其功能的改變必然引起諸多器官、組織功能、形態(tài)的異常，繼而造成患者生活上的困難。本實驗選用SD大鼠建立D-半乳糖亞急性衰老模型，觀察衰老大鼠下頜下腺谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)的改變及探討細胞衰老與端粒酶活性的關(guān)系，為預防衰老奠定細胞學的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 PCR儀(美國MJResearch公司)；DY892 1型電動勻漿機(寧波新芝科器研究所)；721W可見光分光光度計(中國上海)；LD5-2A 離心機、旋渦混勻器(中國北京)；細胞裂解試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)；端粒酶活性檢測TRA-ELISA試劑盒(Roche公司)；GSH-Px 試劑盒、T- AOC試劑盒(南京建成生物工程公司)。

1.2實驗動物的選擇及模型的建立 實驗大鼠購自河北省實驗動物中心(合格證編號：605106)，選用8周齡清潔級SD雌性大鼠10只，體重180～220 g，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，自然光照，隨機分為正常組和模型組，每組5只。正常組大鼠正常喂60 d。模型組大鼠稱重后按0.5 ml·100 g-1·d-1(300 mg/kg)腹腔注射6% D-半乳糖，1次/d，連續(xù) 60 d。

1.3新鮮標本的取材方法 正常組及模型組大鼠末次給藥后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪開頸部皮膚暴露出下頜下腺，分離并摘取下頜下腺，置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4下頜下腺組織抗氧化能力的檢測 下頜下腺組織冰浴中用Tris緩沖液制勻漿 -20℃冷凍保存。GSH-Px 活力檢測：10%下頜下腺組織勻漿 0.2 ml 按試劑盒操作法測 OD 值。T-AOC的檢測：取10%下頜下腺組織勻漿0.2 ml，按測試盒操作法加入試劑，37℃水浴中溫育30 min，按測試盒操作法加入試劑，旋渦混勻器充分混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，1 cm光徑比色杯，于520 nm處，測各管吸光度值。

1.5采用端粒重復擴增-微孔板雜交法檢測下頜下腺細胞端粒酶活性

1.5.1組織的處理及端粒酶的提取 取40～100 mg(-70℃)冷凍下頜下腺組織用冰預冷的洗液洗1次，4℃，10 000 r/min離心1 min，沉淀加200 μl冷裂解液懸浮，冰浴25 min，4℃，16 000 r/min離心20 min，移取上清液，-70℃冰箱保存。

1.5.2檢測端粒酶活性 使用端粒酶活性檢測TRA-ELISA試劑盒(德國Roche公司)，按試劑說明書的操作步驟，進行端粒序列的復制、TRAP擴增、產(chǎn)物的固相與雜交及ELISA檢測，于450 nm處測吸光度值，按公式計算端粒酶的相對活性。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1衰老模型的評價 模型組大鼠每天用電子天平測體重以確定用藥劑量，同時觀察大鼠毛色、行為等外觀特征的改變。實驗前，各組大鼠毛色白，有光澤，精神狀態(tài)良好，行動正常。隨著實驗的進展，模型組大鼠出現(xiàn)毛色變黃、無光澤、脫毛嚴重、行為遲緩等衰老體征。

2.2各組大鼠下頜下腺組織抗氧化能力的檢測結(jié)果 模型組GSH-Px、T-AOC表達最低(15.64±3.94、0.19±0.14)U/ml，正常組最高(92.74±3.74、2.04±0.17)U/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3端粒酶活性檢測結(jié)果 模型組端粒酶OD值(0.03±0.06)最低，正常組(0.28±0.51)最高(P<0.01)。

3 討 論

衰老的自由基理論認為衰老過程中的退行性變化是由于人體在正常的新陳代謝或各種應急情況下產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。正常情況下，人體自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。自由基清除系統(tǒng)是生物體內(nèi)的抗氧化保護系統(tǒng)。它們能夠隨時清除體內(nèi)多余的自由基，保持自由基的平衡。但如果自由基產(chǎn)生過多或清除障礙時，動態(tài)平衡就被打破，導致組織器官的退行性改變和衰老的發(fā)生。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，能清除細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(ROOH)和H2O2，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化氫的氧化損傷，因此GSH-Px活性的變化也可反映機體抗氧化能力的變化。本研究說明下頜下腺與其他組織一樣，隨衰老其氧化水平，抗氧化能力發(fā)生明顯改變。

近年發(fā)現(xiàn)細胞衰老與細胞內(nèi)染色體末端端粒長度密切相關(guān)，人類細胞端粒是其染色體末端一段TTAGGG重復序列，防止染色體DNA降解、末端融合、非正常重組和染色體的缺失。被稱為細胞分裂的“定時鐘”。Harley等〔4〕研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的人類細胞每分裂一次，端粒即丟失若干個堿基對，這是由于端粒酶的表達減少所致，有活性的端粒酶對端粒長度的維持起著重要的作用。若端粒酶正常表達,端粒就不會縮短,細胞就不會衰老。端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分含有端粒重復序列的模板(5′-CUAA CCCUAAC-3′)；蛋白質(zhì)組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性。端粒酶能以自身RNA的模板區(qū)為模板，-逆轉(zhuǎn)錄復制合成染色體末端的端粒序列，來維持與染色體穩(wěn)定至關(guān)重要的端粒結(jié)構(gòu)〔5〕。人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄蛋白的成功重組顯示端粒酶和端?？s短與細胞衰老存在著密切的聯(lián)系〔6〕。端粒酶具有促進端粒延伸作用，在沒有端粒酶的細胞中，端粒會逐漸縮短直至染色體損傷；有端粒酶存在的細胞，端粒的長度能得以保持，使之處于一種不斷伸縮的動態(tài)平衡中〔7〕。正常組織中，生殖細胞和部分造血干細胞呈弱端粒酶活性，胚性細胞等增殖活躍的細胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟體細胞中端粒酶失活。如果在正常體細胞中重建端粒酶活性，就可維持細胞的端粒長度，延緩細胞的衰老〔8〕。

4 參考文獻

1Printz C.Scientist honored for role in discovering telomerase〔J〕.Cancer，2010；116(6):1393-4.

2Calado RT，Young NS.Telomere diseases〔J〕.N Engl J Med,2009；361(24):2353-65.

3Song JS，Kim HP，Yoon WS,etal.Adenovirus-mediated suicide gene therapy using the human telomerase catalytic subunit ( hTERT) gene p romoter induced apoptosis of ovarian cancer cell line〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem，2003；67(11):2344-50.

4Harley CB,Futcher AB,Greider CW.Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts〔J〕.Nature,1990；345(6274):458-60.

5Matsuo T,Shay JW,Wright WE,etal.Telomeremaintenance mechanisms in soft-tissue malignant fibrous histiocytomas〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2009；91(4):928-37.

6Bodnar AG,Ouellette M,Frolkis M,etal.Extension of lifespan by introduction of telomerase into normal human cells〔J〕.Science,1998；279(16):349.

7張 婷，王曉民.端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)和意義〔J〕.首都醫(yī)科大學學報，2009；30(5):718-22.

8Granger MP，Wright WE，Shay JW.Telomerase in cancer and aging〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2002；41(1):29-40.