柏杖勇 李清華

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000)

帕金森病(PD)是最常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)失調(diào)性疾病和第二常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病，位列阿爾茨海默病之后。年齡的增長(zhǎng)是散發(fā)性PD發(fā)病的最重要影響因素。許多基因的突變相關(guān)于家族性PD，這些基因包括SNCA〔1〕、parkin〔2〕、 UCHL1〔3〕、PINK1〔4〕、DJ-1〔5〕、LRRK2〔6，7〕、 ATP13A2〔8〕、 GIGYF2〔9〕、Omi/HTRA2〔10〕、 PLA2G6〔11〕和 FBXO7〔12〕。在病理上，PD以投射到紋狀體的黑質(zhì)致密部 (SNc)的多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失為特征。黑質(zhì)紋狀體的退行性改變和紋狀體多巴胺能遞質(zhì)的耗竭是PD患者包括運(yùn)動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)功能減退、僵化、靜止性震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)定等運(yùn)動(dòng)癥狀的最主要原因。然而，神經(jīng)變性的進(jìn)程是不會(huì)局限于多巴胺神經(jīng)元的，也能影響去甲腎上腺素(藍(lán)斑)、羥色胺(中縫背核)、膽堿(Meynert的下橄欖核)系統(tǒng)、大腦皮層、腦干、脊髓和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)〔13～15〕，這也能夠解釋PD的非運(yùn)動(dòng)方面的臨床表現(xiàn)，例如自主神經(jīng)功能紊亂、睡眠障礙、抑郁和認(rèn)知障礙。PD的另一種明顯的病理表現(xiàn)是包含有聚集的a-synuclein〔16〕在內(nèi)的許多蛋白在神經(jīng)細(xì)胞核周的堆積。許多來(lái)自于不同的動(dòng)物等模型的證據(jù)表明，低聚的中間體而不是最終的蛋白聚集體是影響著神經(jīng)系統(tǒng)的毒性過(guò)程〔17，18〕。然而，致病作用和Lewy體的意義仍不清楚〔19，20〕。一方面，Lewy體可能是通過(guò)隔離毒性的沒(méi)有折疊a-synuclein而被賦予保護(hù)神經(jīng)作用；另一方面，他們也許作為儲(chǔ)存器和毒性蛋白的源頭，這是由于蛋白質(zhì)的包含物是動(dòng)態(tài)改變的〔21，22〕，最終，這些儲(chǔ)存的蛋白聚集體通過(guò)蛋白酶體通路和自噬-溶酶體通路得以降解。Lewy體不是出現(xiàn)在所有的PD而是出現(xiàn)在許多家族史患者；然而，在MPTP誘導(dǎo)的人類(lèi)PD中沒(méi)有報(bào)道，可能PD可能沒(méi)有統(tǒng)一的疾病實(shí)體〔23，24〕。散發(fā)性PD的發(fā)病機(jī)制，最主要來(lái)自于PD，可能與基因易感性的可變性以及環(huán)境因素有關(guān)。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，線(xiàn)粒體自噬功能障礙在PD的發(fā)病機(jī)制中扮演者重要的角色。

1 PD的線(xiàn)粒體功能障礙

線(xiàn)粒體功能障礙和PD的直接關(guān)系來(lái)自于死于PD的患者黑質(zhì)的復(fù)合體1描述〔25，26〕，其次是骨骼肌、血小板、淋巴母細(xì)胞線(xiàn)粒體缺陷的個(gè)案報(bào)告〔27〕。大腦內(nèi)的線(xiàn)粒體缺陷僅限于黑質(zhì)，被病理檢查證實(shí)為偶發(fā)的PD〔28〕。在PD的發(fā)病機(jī)制中，線(xiàn)粒體參與的證據(jù)來(lái)自于一個(gè)家族性PD的遺傳原因的發(fā)現(xiàn)。所有的這些都具有黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的丟失和PD的特征。通常，這些具有明顯肌張力障礙和認(rèn)知功能障礙的遺傳性病例的發(fā)病平均年齡早于散發(fā)型PD。然而，許多PINK1或者LRRK2突變的病例，從臨床上不能和散發(fā)性PD相鑒別。許多突變表達(dá)或敲除的模型已被發(fā)現(xiàn)有線(xiàn)粒體功能障礙〔29〕。

受損的線(xiàn)粒體功能導(dǎo)致了PD的神經(jīng)退變，是基于PD患者大腦的生物化學(xué)和病理解剖學(xué)研究，這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步被氧化毒性等所證實(shí)。直接影響線(xiàn)粒體能量代謝的復(fù)合體1的拮抗劑導(dǎo)致了人類(lèi)和各種動(dòng)物模型的PD。最近，發(fā)現(xiàn)了對(duì)于罕見(jiàn)的遺傳性PD的線(xiàn)粒體具有保護(hù)作用的基因功能特征的在線(xiàn)粒體內(nèi)環(huán)境平衡改變的潛在分子信號(hào)通路。在軸突轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸的信號(hào)、細(xì)胞器的退變和細(xì)胞內(nèi)能量的供給方面，線(xiàn)粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，被不斷適應(yīng)功能的形態(tài)和結(jié)構(gòu)所嚴(yán)格調(diào)控。這個(gè)通路涉及線(xiàn)粒體質(zhì)量控制，確立了功能障礙的線(xiàn)粒體是通過(guò)PINK1/parkin通路來(lái)自噬清除，提示PD相關(guān)的蛋白在線(xiàn)粒體層面上的復(fù)雜的相互作用。用線(xiàn)粒體保護(hù)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)解釋也許可以幫助我們理解PD的通過(guò)線(xiàn)粒體和(或)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)的改變來(lái)調(diào)節(jié)自身的平衡〔30〕。

2 PINK1

PINK1，一種PD相關(guān)蛋白，具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性〔31〕。PINK1包含有線(xiàn)粒體目標(biāo)信號(hào)和公認(rèn)的跨膜序列〔32〕，人們已經(jīng)確認(rèn)了細(xì)胞質(zhì)里與PINK1有關(guān)的蛋白〔33～35〕。在正常線(xiàn)粒體中，PINK1蛋白存在于線(xiàn)粒體外膜，它的激酶的功能區(qū)面向細(xì)胞質(zhì)〔36〕。PINK1能夠作為受損線(xiàn)粒體的分子感受器，當(dāng)用線(xiàn)粒體實(shí)驗(yàn)性去極化去模仿線(xiàn)粒體損傷，使用線(xiàn)粒體解耦聯(lián)劑carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP)減少了整個(gè)線(xiàn)粒體內(nèi)膜的膜電位，需要蛋白質(zhì)的TIM調(diào)節(jié)的線(xiàn)粒體進(jìn)入——PINK1基因不再作為MPP或者PARL和全長(zhǎng)64 kD的形式迅速堆積的進(jìn)程，使用其激酶功能區(qū)跨越線(xiàn)粒體外膜而面向細(xì)胞質(zhì)。

線(xiàn)粒體外膜上的PINK1的穩(wěn)定性是parkin募集到受損的線(xiàn)粒體及激發(fā)線(xiàn)粒體自噬所必需的。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個(gè)公認(rèn)的PINK1底物。PINK1可以與線(xiàn)粒體分子伴侶TRAP1〔37〕(就像是 Hsp75)相互作用；這個(gè)研究揭示了PINK1能夠磷酸化TRAP1，這對(duì)于調(diào)節(jié)PINK1的蛋白活力來(lái)拮抗氧化是很重要的。PINK1功能上與線(xiàn)粒體絲氨酸蛋白HtrA2/OMI (hightemperature regulation A2)〔38〕相互作用。P38激酶途徑刺激后，HtrA2/OMI 是以PINK1依賴(lài)的方式磷酸化保守的絲氨酸殘基。在果蠅模型中這條通路的研究提示，HtrA2/OMI作為共同通路的下游蛋白，獨(dú)立于parkin〔39～41〕。PINK1還被發(fā)現(xiàn)與Miro 和Milton 一起出現(xiàn)在許多蛋白復(fù)合體中〔42〕。Miro 和 Milton是在線(xiàn)粒體外膜上連接驅(qū)動(dòng)蛋白重鏈到線(xiàn)粒體，沿著微管順行軸索轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白〔43〕。有趣的是，缺乏線(xiàn)粒體導(dǎo)入序列和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能區(qū)的細(xì)胞質(zhì)里的PINK1是可以保護(hù)小鼠的MPTP誘導(dǎo)的毒性損傷，提示細(xì)胞質(zhì)里的PINK1可能具有保護(hù)神經(jīng)元存活的功能〔44〕。PINK1可以減少基底節(jié)區(qū)神經(jīng)元促凋亡活性和星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。保護(hù)作用的減少可能由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退變所導(dǎo)致的。PD相關(guān)的突變和PINK1激酶失活突變可以減少PINK1的保護(hù)作用。

在parkin或者PINK1不足的細(xì)胞線(xiàn)粒體膜蛋白減少已經(jīng)影響到線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的效率〔43〕。表明PINK1也許具有線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)功能。PINK1的一個(gè)重要的生理功能是增加細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激的抵抗力。PINK1蛋白的過(guò)表達(dá)可以保護(hù)各種毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞的死亡，當(dāng)PINK1耗竭會(huì)增加應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的易感性〔45〕；這些發(fā)現(xiàn)提示，在細(xì)胞應(yīng)激狀況下，PINK1在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性方面具有重要的作用。許多機(jī)制已經(jīng)被解釋PINK1的細(xì)胞保護(hù)作用的活力，包括線(xiàn)粒體的生物能量學(xué)和鈣穩(wěn)態(tài)的維持。

3 parkin

parkin是一種E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligases)，通過(guò)介導(dǎo)底物蛋白的泛素化，調(diào)控蛋白降解和信號(hào)通路等〔46〕，其突變導(dǎo)致了常染色體隱性遺傳青少年型PD(AR-JP)〔47〕。 parkin在許多組織中強(qiáng)烈的表達(dá)，包括腦、骨骼肌、心臟和肝臟組織中，這提示其廣泛表達(dá)具有廣泛的生理意義。parkin是一個(gè)具有465個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在N端一個(gè)泛素樣(UBL)功能區(qū)和一個(gè)靠近C端RBR(RING-between-RING)功能區(qū)。RBR功能區(qū)調(diào)節(jié)鋅離子，由兩個(gè)RING功能區(qū)組成，夾有RING(ibr)功能區(qū)。一個(gè)RING功能區(qū)已經(jīng)被鑒定是位于UBL和RBR的生物序列之間，具有鋅離子結(jié)合能力〔48〕。依賴(lài)于線(xiàn)粒體膜電位的改變，parkin蛋白可以定位于細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體。

parkin能夠催化共價(jià)結(jié)合的泛素到底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基。parkin能夠分辨不同的泛素化模型，延伸單泛素到泛素分子內(nèi)的包含不同賴(lài)氨酸殘基的多聚泛素鏈(例如Lys48-和Lys63-連接的泛素鏈)。由于泛素內(nèi)部的7-賴(lài)氨酸殘基的存在，影響了具有不同結(jié)構(gòu)和功能的多聚泛素鏈形成〔49～51〕。

通常情況下，lys48連接的泛素鏈經(jīng)由蛋白酶體通路降解的目標(biāo)底物結(jié)合。已確認(rèn)的parkin的底物有突觸囊泡相關(guān)蛋白CDCrel-1、parkin相關(guān)內(nèi)皮受體樣受體Pael-R、22 kD的糖基化a-synuclein和synphilin-1等。然而其他泛素的連接在DNA修復(fù)、胞吞作用和自噬的信號(hào)傳導(dǎo)方面具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。parkin表達(dá)的增加，能夠保護(hù)細(xì)胞線(xiàn)粒體毒物，細(xì)胞內(nèi)和動(dòng)物模型中的興奮性毒物，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白毒性應(yīng)激等誘導(dǎo)的細(xì)胞的死亡〔52～55〕。

parkin可以參與線(xiàn)粒體功能蛋白(亞基復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ)表達(dá)，parkin KO 小鼠的中腦側(cè)腹部的氧化應(yīng)激反應(yīng)是增加的〔56〕，因此，從parkin缺陷的小鼠紋狀體分離的線(xiàn)粒體的呼吸能力是減少的〔56〕。ATP生產(chǎn)的減少反映了線(xiàn)粒體功能的改變也在攜帶parkin病理性突變患者的皮膚成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)〔57〕。許多途徑已經(jīng)涉及parkin的神經(jīng)保護(hù)活力，例如核因子(NF)-κB途徑〔58，59〕，JNK信號(hào)〔60，61〕和PI3K 信號(hào)〔62，63〕。

4 PINK1/parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬

當(dāng)在培養(yǎng)的細(xì)胞中PINK1和parkin的過(guò)表達(dá)，parkin能夠被PINK1純化，反之亦然〔64〕。Kim等〔65〕研究表明PINK1和 Parkin通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能的不同方面維持線(xiàn)粒體的完整性，包括膜電位，內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，線(xiàn)粒體嵴結(jié)構(gòu)，線(xiàn)粒體呼吸活性以及mtDNA完整性。PINK1募集parkin到線(xiàn)粒體是通過(guò)磷酸化parkin的一個(gè)RING0功能區(qū)蘇氨酸殘基。在其他實(shí)驗(yàn)中也同樣被發(fā)現(xiàn)，PINK1可以磷酸化parkin，表明parkin的催化lsy-63連接的多聚泛素化作用的泛素鏈E3泛素連接酶活性是在PINK1誘導(dǎo)的parkin的磷酸化以后加強(qiáng)的〔66〕。是RING-finger 1功能，而不是E3泛素連接酶的活力，需要parkin和PINK1的相互作用。PINK1磷酸化parkin，這種磷酸化能夠被PD連接的突變消除。在與UbcH13/Uev1a E2酶合作以后，PINK1相關(guān)的磷酸化能加強(qiáng)parkin的E3連接酶催化k63連接的多聚泛素鏈的活力〔67〕。當(dāng)線(xiàn)粒體因氧化應(yīng)激等某些因素受損而致線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)去極化后，可以促使線(xiàn)粒體上的PINK1 激活parkin，并使parkin從細(xì)胞質(zhì)特異性地轉(zhuǎn)移到受損的線(xiàn)粒體外膜上〔68〕，繼而催化線(xiàn)粒體外膜上相關(guān)的蛋白被多聚泛素鏈泛素化，泛素化后的線(xiàn)粒體在VDAC1、p62/SQSTM1等自噬調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)助下，沿著微管轉(zhuǎn)運(yùn)到核周并形成線(xiàn)粒體聚集體〔69，70〕，然后被自噬-溶酶體通路(ALP)降解，這樣，PINK1和parkin聯(lián)合作用使受損的線(xiàn)粒體以完整細(xì)胞器的形式選擇性地被自噬清除，這一過(guò)程被稱(chēng)為PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬(PINK1/Parkin-mediated mitophagy)〔71，72〕，而當(dāng)PINK1或parkin突變后，自噬對(duì)受損線(xiàn)粒體的清除則明顯被抑制，導(dǎo)致受損的線(xiàn)粒體在細(xì)胞內(nèi)的堆積，進(jìn)一步損害了細(xì)胞正常生理功能〔73〕。

Ambra1(activating molecule in Beclin1-regulated autophagy，Beclin1)通過(guò)刺激對(duì)于新的phagophores的形成class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)復(fù)合體的活力來(lái)激活自噬。Ambra1不需要parkin轉(zhuǎn)位到去極化的線(xiàn)粒體，而是對(duì)于繼發(fā)的線(xiàn)粒體清除非常重要的作用。特別是，Ambra1被募集到去極化的線(xiàn)粒體的核周聚集體，激活附近的class Ⅲ PI3K。有數(shù)據(jù)確定，parkin和Ambra1的相互作用是parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬的最終清除步驟的誘導(dǎo)的關(guān)鍵機(jī)制〔74〕。

PINK1-parkin依賴(lài)的線(xiàn)粒體自噬表明，mitofusins 1 和mitofusins 2的泛素化是一個(gè)早期階段。mitofusins的泛素化可能促進(jìn)線(xiàn)粒體的降解，潛在的活性線(xiàn)粒體自噬可以作為影響大腦和肌肉疾病的一種治療方法〔75〕。

無(wú)論parkin或者PINK1去功能化所導(dǎo)致的線(xiàn)粒體形態(tài)學(xué)和ATP產(chǎn)生的改變都可以被線(xiàn)粒體融合蛋白Mfn2和OPA1或者Drp1所解救。Parkin和PINK1是可以抑制Drp1導(dǎo)致的線(xiàn)粒體分裂。此外，在Drp1不足的細(xì)胞中，敲除parkin/PINK的表型是不會(huì)出現(xiàn)的，這表明，在parkin或者 PINK1不足的細(xì)胞中，線(xiàn)粒體改變與線(xiàn)粒體增長(zhǎng)的分裂有關(guān)〔76〕。ATF4，一個(gè)未折疊蛋白應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)了parkin對(duì)線(xiàn)粒體的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，然而，c-Jun抑制了parkin的表達(dá)〔77〕。

在PINK1沉默的MN9D細(xì)胞中，C2-神經(jīng)酰胺(PP2A激動(dòng)劑)治療可以減少自噬水平，提示，PP2A在PINK1敲除誘導(dǎo)的自噬途徑中，具有重要的作用。PP2A的失活參與PINK1沉默的自噬蛋白保護(hù)作用。PINK1沉默的細(xì)胞中，PP2A活力的下調(diào)通過(guò)促進(jìn)Bcl-2在S87磷酸化的神經(jīng)保護(hù)作用和凋亡通路來(lái)阻止〔78〕。

在線(xiàn)粒體自噬這一過(guò)程中，PINK1是怎么發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體受損，并且對(duì)解耦聯(lián)做出反應(yīng)并募集parkin？PINK1是怎樣在個(gè)體細(xì)胞中，區(qū)別受損和健康的線(xiàn)粒體，并介導(dǎo)了parkin的募集，僅僅是解耦聯(lián)細(xì)胞器？盡管有報(bào)道，PINK1結(jié)合和磷酸化parkin，關(guān)于PINK1募集parkin到線(xiàn)粒體仍未闡明。

5 展 望

盡管，有許多PD相關(guān)的基因陸續(xù)被克隆出來(lái)，但是，這些基因所表達(dá)的蛋白的功能改變僅是從一方面闡釋了PD的發(fā)病機(jī)制，到目前為止還沒(méi)有一種理論能夠完全闡釋PD的發(fā)病機(jī)制。但是，有一點(diǎn)是可以肯定的，那就是涉及線(xiàn)粒體自噬的線(xiàn)粒體損傷與修復(fù)。新的基因或者功能蛋白的發(fā)現(xiàn)，必然會(huì)為人們揭示PD的發(fā)病機(jī)制提供更加有力的證據(jù)。有一點(diǎn)是可能的——線(xiàn)粒體自噬可能成為PD治療的靶點(diǎn)。對(duì)于有機(jī)體來(lái)說(shuō)，輕度自噬可能有助于蛋白聚集體的清除，然而，過(guò)度自噬可能誘發(fā)集體細(xì)胞的不可逆的功能改變，甚至死亡。所以，如何控制線(xiàn)粒體自噬在一個(gè)溫和而有效的范圍和程度，對(duì)于PD將是一個(gè)新的挑戰(zhàn)性的治療策略。

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