賀 琴 李德梅 譚華炳

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是2型糖尿病(T2DM)主要并發(fā)癥之一，T2DM患者NAFLD檢出率為50.45%〔1〕。NAFLD導(dǎo)致高脂血癥、動脈粥樣硬化、T2DM〔2～4〕。絞股藍(lán)及絞股藍(lán)皂甙(GPS)能夠降低NAFLD兔肝臟脂質(zhì)沉積量〔5〕，有治療T2DM、代謝綜合征(MS)作用〔6，7〕。本研究通過高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD大鼠模型，觀察GPS對T2DM并NAFLD大鼠肝細(xì)胞核因子(HNF)-1α的影響，探討GPS是否是通過干預(yù)HNF-1α達(dá)到防治T2DM并NAFLD的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 65只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供〔合格證號：No.scxk(湘)2009-0004〕。實(shí)驗(yàn)場地湖北省十堰市實(shí)驗(yàn)動物中心(湖北省實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用證明號：00015644)。

1.2實(shí)驗(yàn)飼料 普通飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養(yǎng)基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成，蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心按實(shí)驗(yàn)配方配制成成品使用(配方：78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制成成品使用(配方：82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?/p>

1.3.1實(shí)驗(yàn)動物的分組 SD大鼠購入后，普通飼料飼養(yǎng)觀察1 w，動物無死亡及不良反應(yīng)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將65只大鼠分為空白對照組(7只，N組)，NAFLD模型組(NM組，7只)，T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.3.2T2DM并NAFLD造模與干預(yù) 參照文獻(xiàn)〔9〕，每鼠每天高糖高脂飼料20 g左右，分兩次投入，喂養(yǎng)4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)40 mg/kg，48 h后尾靜脈取血，血糖>11.1 mmol/L，納入實(shí)驗(yàn)組，造模成功率為100%；繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)至8 w，建立T2DM并NAFLD模型。期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只，JH組)，給予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃；GPS小劑量組(9只，JL組)，給予GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃；T2DM并NAFLD模型對照組(9只，M組)同等體積的純凈水灌胃；繼續(xù)給予高糖高脂飼料，自由飲水；治療周期為6 w；實(shí)驗(yàn)周期14 w。

1.3.3N組、NM組飼養(yǎng)與管理 N組每天給予普通飼料20 g左右(根據(jù)NAFLD組進(jìn)食量調(diào)整)；MN組給予高脂飼料20 g左右(依據(jù)前一天進(jìn)食量決定第二天進(jìn)食量)；飼料分2次投入。自由飲水。實(shí)驗(yàn)周期14 w。

1.4肝臟病理學(xué)檢測 在肝臟最大葉，取肝組織0.5 cm，常規(guī)規(guī)定、切片、HE染色，檢測肝臟病理學(xué)變化。

1.5常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備 STZ購于美國Sigma公司。GPS購自安康東科麥迪森天然藥業(yè)有限公司，純度為98%。Olympus DP-70顯微攝影系統(tǒng)(日本，奧林巴斯公司)。

1.6HNF-1α檢測設(shè)備、試劑、方法

1.6.1檢測設(shè)備、試劑 Heal Force離心機(jī)(臺式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R)。PCR儀(Hangzhou Bioer Teechnology Co.，LTD；Life express Thermal Cycler)。熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司，SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng))；超凈工作臺(蘇凈安泰公司，SW-CJ-1FD)?？俁NA提取試劑Trizol Reagent(15596-026，Invitrogen Life Technologies生產(chǎn))；離心管、TIP頭均購自Axygen Biosciences公司。ReverTra Ace-α反轉(zhuǎn)錄(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)SK-100)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，QPS-201)。引物由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成。

1.6.2檢測方法 總RNA抽提(取勻漿器，加入1 ml的Trizol試劑，置冰上預(yù)冷；取100 mg組織，加入到勻漿器中；充分研磨直至無可見組織塊；加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min；4℃離心8 min；將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻；-20℃放置15 min；4℃離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；吸除液體，加入75%乙醇1.5 ml洗滌沉淀；4℃離心5 min；將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min；加入20 μl無RNA酶的水溶解RNA。反轉(zhuǎn)錄:取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液；加入1 μl oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μl；于PCR儀上70℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻；依次加入4 μl 5倍緩沖液，2 μl 10 mmol/L dNTPs，1 μl RNA抑制劑和1 μl反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫30 min，結(jié)束后80℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶)。定量PCR(取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L基因引物 2.0 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl；取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L內(nèi)標(biāo)引物 2.0 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR擴(kuò)增：預(yù)變性 95℃ 1 min，循環(huán)(40次) 95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s，末段延 72℃ 5 min，溶解曲線 72℃→95℃，每20 s升溫1℃。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS9.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)過程中大鼠數(shù)量變化 同文獻(xiàn)〔9，10〕，模型組在T2DM并NAFLD造模過程中，死亡大鼠15只，死亡率為29.41%；在干預(yù)過程中，JH、JL、M組分別有1、2、3只大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束JH組實(shí)有大鼠8只，JL組實(shí)有大鼠7只，M組實(shí)有大鼠6只。NM組實(shí)驗(yàn)過程中死亡1只，實(shí)有大鼠6只。N組大鼠飼養(yǎng)過程中無死亡。實(shí)驗(yàn)開始有大鼠65只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束實(shí)有大鼠34只。

2.2HNF-1α變化 以N組擴(kuò)增倍數(shù)為1計(jì)算，MN組HNF-1α表達(dá)為0.85，與N組比較有顯著差異(P<0.05)；M組為0.62，與N組比較有顯著差異(P<0.01)；JH治療組HNF-1α升至0.80，與M組比較有顯著差異(P<0.01)；JL治療組HNF-1α升至0.68，與M組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.3肝臟病理學(xué) N組為正常肝臟，NM組為重度脂肪肝，M組脂肪肝程度最嚴(yán)重；JL組與NM組程度相似；JH組脂肪肝程度最輕。

3 討 論

T2DM由于與NAFLD在發(fā)病機(jī)制上存在“共同土壤”胰島素抵抗(IR)而成為其重要病因〔11〕。HNF-1α是調(diào)控許多肝功能基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，對促進(jìn)肝臟發(fā)育和維護(hù)肝細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)揮重要作用〔11〕。HNF-1α在肝臟內(nèi)高水平表達(dá)，參與肝臟糖、脂代謝相關(guān)基因特異性表達(dá)的調(diào)控〔10〕。HNF-1α是否參與T2DM并NAFLD的發(fā)病，以及GPS是否是通過影響HNF-1α達(dá)到治療目的，是本研究關(guān)注的問題。研究顯示T2DM并NAFLD大鼠糖脂代謝能力下降，肝細(xì)胞其他生理學(xué)功能下降，加重糖尿病和NAFLD發(fā)展。GPS對T2DM并NAFLD大鼠HNF-1α定下降具有干預(yù)作用，從而改善糖脂代謝，打斷惡性循環(huán)。至于GPS通過何途徑抑制HNF-1α有待進(jìn)一步研究。中醫(yī)認(rèn)為T2DM合并NAFLD是由于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié)?，F(xiàn)代藥理研究證明絞股藍(lán)含有83種與人參皂甙有類似骨架的達(dá)瑪烷型絞股藍(lán)皂甙，皂甙具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性和藥理作用〔11〕，Norberg等〔12〕從絞股藍(lán)中分離提純出一種新的皂甙，存在4種可以相互轉(zhuǎn)化的立體異構(gòu)體，在體外及動物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，其可刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素，且呈現(xiàn)劑量依賴性。Xu等〔13〕發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度。本研究提示，GPS具有多靶點(diǎn)干預(yù)T2DM并NAFLD作用，在防治T2DM并NAFLD方面具有一定的優(yōu)勢。本研究提示，GPS通過調(diào)整肝組織HNF-1α表達(dá)，對T2DM并NAFLD具有治療作用，結(jié)合既往研究說明GPS多靶點(diǎn)治療T2DM并NAFLD。

4 參考文獻(xiàn)

1李勇杰，蘇宏業(yè)，李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝檢出率及臨床特點(diǎn)〔J〕.廣西醫(yī)學(xué)雜志，2012；34(1)：86-8.

2謝杏榕，譚華炳，胡小林，等.不同程度非酒精性脂肪性肝病兔的血糖變化〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(2)：636-7.

3譚華炳，李金科，胡 波,等.非酒精性脂肪性肝病兔胰島素水平變化及其機(jī)理探討〔J〕.西南國防醫(yī)藥雜志，2010；20(9)：937-9.

4譚華炳，賀 琴.脂肪肝與血液流變學(xué)、C反應(yīng)蛋白異常的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009；29(13)：1662-4.

5劉其政，孫希杰，譚華炳，等.絞股藍(lán)抑制非酒精性脂肪性肝病兔肝臟脂質(zhì)沉積的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2011；21(4)：224-6,封底

6賀 琴，譚華炳.絞股藍(lán)防治2型糖尿病及心腦腎并發(fā)癥研究進(jìn)展〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008；6(8)：957-8.

7譚華炳,賀 琴.絞股藍(lán)防治代謝綜合征研究進(jìn)展〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2008；35(7)：1115-6.

8王戰(zhàn)建,張 耀，宋慶芳，等.二甲雙胍對高糖高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠脂肪肝治療作用的研究〔J〕.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2006；26(20)：1603-5.

9賀 琴，雷飛飛，李儒貴，等.絞股藍(lán)皂苷降低2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠血糖、血脂的機(jī)理研究〔J〕.湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013；32(1)：39-43,封3.

10閩懷臻，賀 琴，李金科，等.絞股藍(lán)皂苷對2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)和血硫化氫的影響〔J〕.湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013；32(4)：317-24.

11Costa RH，Kalinichenko VV，Holterman AX,etal.Transcription factors in liver development，differentiation，and regeneration〔J〕.Hepatology，2003；38(6)：1331-47.

12Stoffel M，Duncan SA.The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription factor HNF 4α regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997；94(24)：13209-14.

13張 娟，路金才.皂甙的提取方法及含量測定研究進(jìn)展〔J〕.中國現(xiàn)代中藥雜志，2006；8(3)：25-8.

14Norberg A，Hoa NK，Liepinsh E,etal.A novel insulin-releasing substance，phanoside，from the plant Gynostemma pentaphyllum〔J〕.J Biol Chem，2004；279(40):41361-7.

15Xu JQ，Shen Q，Li J,etal.Dammaranes from Gynostemma pentaphyllum and synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B〔J〕.Bioorg Med Chem，2010；18(11)：3934-9.