強(qiáng) 靜 馬芹穎 顧 平 王彥永 王銘維

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

阿爾茨海默病(AD)其主要的組織病理學(xué)特點(diǎn)是神經(jīng)元的大量丟失和細(xì)胞外老年斑(SP)的沉積以及細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白所形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)〔1〕。大量研究表明，病理性的淀粉樣蛋白(Aβ)是SP的主要組成成分，Aβ具有很強(qiáng)的聚集特性，其過度聚集可以通過氧化應(yīng)激、影響細(xì)胞對Ca2+的緩沖能力等多種機(jī)制造成AD患者神經(jīng)元大量丟失和突觸的損傷〔2～4〕，在AD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，很多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病都與自噬能力的下降有關(guān)〔5，6〕。有研究表明，一些藥物可以提高AD模型小鼠體內(nèi)的自噬水平，降低其腦內(nèi)Aβ的水平，并改善小鼠的認(rèn)知功能〔7〕。環(huán)孢素A(CsA)是一種臨床應(yīng)用廣泛的免疫抑制劑，可減輕器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)。CsA對神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，如在一定程度上減輕創(chuàng)傷性腦損傷和促進(jìn)脊髓損傷后的恢復(fù)等〔8，9〕。但是，CsA是否具有提高自噬水平的效應(yīng)及對AD的病理改變有無改善作用，目前尚無明確報道。本研究探討CsA對于Aβ25～35誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞損傷有無保護(hù)作用，及其機(jī)制是否與自噬通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1藥品及試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司；Aβ25～35、多聚賴氨酸購自Sigma公司、Hoechst、碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、CsA購自河北博海生物工程公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞為美國匹茲堡大學(xué)惠贈。細(xì)胞使用含10%胎牛血清、5%馬血清、100 ng/L鏈霉素、0.1 U/L青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，隔天換液一次。待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶底的80%～100%時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Aβ25～35使用無菌磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋成1 mmol/L儲存液，過濾后于37 ℃孵育5～7 d，分裝凍存于-20 ℃冰箱。CsA溶于無菌二甲基亞砜(DMSO)中，儲存濃度為500 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩TT溶于無菌PBS，濃度為5 mg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3MTT法檢測細(xì)胞活力 將PC12細(xì)胞傳代接種于多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，接種密度約為1×104個/孔。分為空白對照組、Aβ處理組、CsA+Aβ處理組，每組設(shè)5個復(fù)孔。細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，CsA+Aβ處理組分別給予0.1、0.5、1.0 μmol/L環(huán)孢素A預(yù)處理24 h，空白組僅更換新鮮培養(yǎng)液。隨后除空白組外各組給予20 μmol/L的Aβ25～35，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去各孔培養(yǎng)液，每孔注入100 μl新鮮培養(yǎng)液和20 μl MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸凈并棄去混合液，各孔中加入150 μl無水DMSO，震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長下的光密度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4Hoechst/PI雙染法檢測細(xì)胞存活率 PC12細(xì)胞傳代后接種于多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板中，每孔約4×104個。分組同上。經(jīng)同樣的CsA和Aβ處理后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入無菌PBS緩沖液稀釋的濃度為20 μg/ml的Hoechst染液0.5 ml，避光孵育5 min,PBS輕柔漂洗5 min×3次后，加入10 μg/ml的PI染液，避光孵育15 min。PBS輕柔漂洗5 min×3次后，使用倒置熒光顯微鏡觀察，計數(shù)存活/死亡細(xì)胞，并計算細(xì)胞存活率。每孔隨機(jī)選取5個視野，計算時取平均值進(jìn)行統(tǒng)計，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5細(xì)胞免疫熒光染色法檢測PC12細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(LC3)表達(dá)水平 給予各組PC12細(xì)胞相應(yīng)處理后，PBS緩沖液漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min。PBS緩沖液漂洗5 min×3次后，用含5%山羊血清、0.3%Triton X-100的PBS液與37 ℃封閉處理50 min，用兔多抗LC3B一抗(Abcam,1∶1 000)4 ℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶100)37℃孵育30 min，PBS緩沖液漂洗后以Hoechst復(fù)染胞核2 min，PBS緩沖液漂洗5 min×3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察各組PC12細(xì)胞的LC3表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料多組間比較采用方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Aβ25～35與CsA對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 將各組PC12細(xì)胞分別進(jìn)行相應(yīng)處理后，置于倒置顯微鏡下，觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差別。正常對照組的PC12細(xì)胞生長狀態(tài)良好，胞體飽滿，突起伸展充分，貼壁良好。給予20 μmol/L的Aβ25～35處理24 h后，細(xì)胞狀態(tài)明顯變差，胞體變暗，突起短小，視野內(nèi)可見大量脫落的細(xì)胞碎片。0.1、0.5、1.0 μmol/L CsA預(yù)處理24 h后，再給予20 μmol/L Aβ25～35繼續(xù)培養(yǎng)24 h，0.5 μmol/L CsA處理組的PC12細(xì)胞狀態(tài)與單純Aβ組相比有明顯改善，貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞碎片少見。

2.2Aβ25～35與CsA對PC12細(xì)胞活力的影響 單純Aβ25～35處理組細(xì)胞光密度值較空白組明顯降低(0.38±0.015 vs 0.58±0.045，P<0.001)；0.5 μmol/L CsA預(yù)處理的PC12細(xì)胞OD值與Aβ25～35處理組相比明顯增高(0.45±0.045，P<0.05)。0.1、1.0 μmol/L CsA預(yù)處理組對PC12細(xì)胞活力(0.31±0.018，0.34±0.034)及代謝狀態(tài)無明顯改善作用。

2.3Aβ25～35與CsA對PC12細(xì)胞存活率的影響 以PI標(biāo)記死亡細(xì)胞，Hoechst標(biāo)記所有細(xì)胞胞核，對活細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分?？瞻讓φ战M細(xì)胞存活率最高(98%)，20 μmol/L Aβ25～35處理組(81.8%)細(xì)胞存活率較對照組明顯降低(P=0.007)；0.5 μmol/L CsA預(yù)處理24 h(95.9%)后，再加入Aβ繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞存活率較單純Aβ組有明顯改善(P=0.012)。

2.4Aβ25～35與CsA對PC12細(xì)胞自噬的影響 倒置熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，正常PC12細(xì)胞的LC3熒光較強(qiáng)，反映出其基礎(chǔ)自噬水平較高；Aβ25～35處理組細(xì)胞LC3熒光強(qiáng)度下降明顯，說明給予20 μmol/L Aβ25～35可以明顯抑制PC12細(xì)胞的自噬活性，而在給予Aβ25～35之前對細(xì)胞進(jìn)行0.5 μmol/L CsA預(yù)處理24 h可以明顯減弱其對PC12細(xì)胞自噬活性的抑制作用。

3 討 論

Aβ具有較強(qiáng)的聚集能力，聚集后形成的寡聚體纖維可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，是導(dǎo)致神經(jīng)元變性、丟失乃至形成癡呆的關(guān)鍵因素〔10〕。目前，對Aβ25～35進(jìn)行孵育使其聚集為寡聚體并用于體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的方法在神經(jīng)科學(xué)的研究中廣泛應(yīng)用；而PC12細(xì)胞具有良好的神經(jīng)細(xì)胞特性，因此常作為神經(jīng)細(xì)胞理想的體外模型加以利用。本研究中采用20 μmol/L Aβ25～35寡聚體作用于PC12細(xì)胞24 h，細(xì)胞的形態(tài)變差，活力明顯下降，并有部分細(xì)胞死亡，成功地建立了AD的體外細(xì)胞模型。

自噬是溶酶體對受損細(xì)胞器和老化、毒性蛋白進(jìn)行吞噬降解的一種主動清除方式。正常細(xì)胞具有一定的基礎(chǔ)自噬水平，以清除細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白和受損細(xì)胞器，促進(jìn)體內(nèi)蛋白的循環(huán)利用，這對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和行使正常生理功能起著積極的作用〔11〕。近期有研究發(fā)現(xiàn)，在AD等老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，存在自噬水平的降低〔12〕，可能與這類疾病的發(fā)病有關(guān)，目前其具體機(jī)制尚不明確。適度提高自噬溶酶體途徑(ALP)的活性，可以加速有聚集傾向的蛋白的降解，有可能對Aβ等蛋白沉積引起的神經(jīng)退行性疾病如AD起到治療作用〔11〕。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬通路中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，雷帕霉素是一種mTOR的特異性抑制劑。有研究表明，雷帕霉素可以改善AD動物模型受損的認(rèn)知功能，在體內(nèi)和體外研究中均可降低Aβ的水平〔7〕，其可能的機(jī)制為雷帕霉素抑制了mTOR的磷酸化，減輕了mTOR對自噬活性的抑制，從而提高了自噬水平，使具有毒性作用的Aβ寡聚體加速降解，最終起到保護(hù)作用。

CsA作為一種免疫抑制劑已廣泛用于臨床，預(yù)防器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生。越來越多的研究表明，CsA還具有神經(jīng)保護(hù)作用，如在一定程度上減輕創(chuàng)傷性腦損傷和促進(jìn)脊髓損傷后的恢復(fù)等〔8，9〕。目前已知的CsA發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能涉及以下方面：封閉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(MPTP)，在損傷因素存在時維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，以及降低損傷部位星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度反應(yīng)活性。本研究成功建立了Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞的體外模型，并證實(shí)環(huán)孢素對Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。而對于作用機(jī)制的初步研究發(fā)現(xiàn)，這種保護(hù)作用可能與CsA提高PC12細(xì)胞的自噬活性有關(guān),自噬通路可能是CsA發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的一個新的機(jī)制。雖然CsA與雷帕霉素均為免疫抑制劑，但是兩者提高自噬活性的具體機(jī)制是否相同，CsA的這種作用在體內(nèi)是否仍然存在，這些問題仍需要更深入的研究。

CsA在臨床上常用于預(yù)防器官移植患者的術(shù)后排斥反應(yīng)，其治療效果和不良反應(yīng)相對明確，而其提高自噬活性的作用使其有望成為治療AD的一種新型藥物。

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