張芳 綜述 李洋 周清華 審校

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼的RNA序列，一般由21-23 nt組成單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中[1]，通過對靶miRNA的直接分解或抑制其翻譯的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[2]，RNAase III超家族成員Drosha剪切pri-miRNA形成pre-miRNA，后者進(jìn)而被Dicer剪切形成成熟的miRNA[3]。

1 微小RNA在腫瘤中的生物學(xué)功能

1993年Lee等[4]在酵母中發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7失活使上皮細(xì)胞傾向于分裂而不是正常分化，提示miRNA具有重要的生理功能。2002年Calin等[5]首次在慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia, CLL）中發(fā)現(xiàn)has-miR-15a和has-miR-16-1下降或缺失，確立了miRNA與腫瘤的相關(guān)性。miRNAs參與生理、病理過程，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中，不同的miRNAs分別發(fā)揮抑制腫瘤（tumor suppressor miRNA, TSmiRs）或促進(jìn)腫瘤作用（oncogenic miRNAs,oncomiRs）[6]。過去的研究[7]表明miRNA基因表達(dá)的改變幾乎與人類大多數(shù)惡性腫瘤病理形成有關(guān)，引起基因表達(dá)改變機制包括：缺失、擴(kuò)增、miRNA位點突變、表觀遺傳基因沉默、以特定miRNAs為靶點的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的紊亂等。Volinia等[8]通過進(jìn)行大規(guī)模的腫瘤miRnome分析，確定了一些腫瘤相關(guān)的miRNA，例如miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a以及miR-155等，它們通過調(diào)節(jié)一些重要的癌基因或抑癌基因表達(dá)影響腫瘤發(fā)生。人們相繼發(fā)現(xiàn)microRNA參與人體多種生命活動，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]、對細(xì)胞的凋亡通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]、參與細(xì)胞周期的調(diào)控[11]、參與人體的代謝過程[12,13]等。MiRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控等，對腫瘤的化療耐藥也具有重要作用。有研究表明miRNA與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。Nicoloso等[14]發(fā)現(xiàn)同種的miRNA不僅使特定腫瘤細(xì)胞具有侵襲能力，而且使腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出特定表型，提示了在腫瘤起源和最后形成的機制之間的聯(lián)系。

Calin等[15]研究證實了miRNA，特別是腫瘤相關(guān)miRNA在染色體上的特殊性，即腫瘤相關(guān)miRNA經(jīng)常定位于一些染色體高變區(qū)域，可能導(dǎo)致LOH，缺失以及擴(kuò)增等，從而引起miRNA表達(dá)變化或突變、缺失等，影響下游腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。他還闡述了miRNA表達(dá)譜在腫瘤診斷、預(yù)后以及治療效果監(jiān)控方面的應(yīng)用[16]。Yu等[17]篩選出胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA，并研究發(fā)現(xiàn)miR17-5p與患者預(yù)后差有關(guān)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。Iorio等[18]通過基因芯片和Northern blot分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中總miRNA表達(dá)與正常組織明顯不同，差異表達(dá)的miRNA與某些乳腺癌生物病理特征有關(guān)，如雌激素和孕酮受體的表達(dá)、腫瘤分期、血管侵襲、增殖指數(shù)。

Mavrakis等[19]應(yīng)用無偏倚的miRNA文庫篩選（unbiased miRNA library screen）的方法，系統(tǒng)研究了急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）相關(guān)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)5個miRNAs（miR-19b、miR-20a、miR-26a、miR-92以及miR-223）在T-ALL發(fā)病中起到關(guān)鍵作用，并且這些miRNAs在T-ALL發(fā)生過程中抑制主要抑癌基因（例如IKZF1、PTEN、BIM、PHF6、NF1、FBXW7等）表達(dá)的作用相互重疊，相互協(xié)調(diào)。該研究揭示了T-ALL發(fā)生中microRNA-腫瘤抑制基因作用的新模式。

細(xì)胞耐藥性是腫瘤化學(xué)治療中的難題，關(guān)于miRNAs與腫瘤細(xì)胞耐藥性的研究很多，也取得了一定的進(jìn)展。Xia等[20]用miRNA芯片篩選出了人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株中miRNAs的異常表達(dá)。miR-15b和miR-16在人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，可以引起B(yǎng)cl-2蛋白表達(dá)的增加，提示miR-15b和miR-16通過靶向作用于Bcl-2而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的形成，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。秦學(xué)博等[21]以吉非替尼敏感肺癌細(xì)胞PC9與吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞PC9/AB11為細(xì)胞模型，初步篩選到了13個與肺腺癌吉非替尼耐藥密切相關(guān)的miRNA。miRNA促進(jìn)或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)藥物耐藥性。

2 順鉑耐藥機制研究

順鉑臨床應(yīng)用于實體瘤中，有較廣的抗癌譜，是已知的最有效的抗瘤藥物之一。順鉑耐藥限制了以順鉑為基礎(chǔ)的化療，順鉑耐藥性的產(chǎn)生機制可能包括：藥物吸收減少、藥物滅活增加、DNA加合物修復(fù)增強。這些產(chǎn)生耐藥的藥理學(xué)機制起源于分子水平的改變，包括DNA損傷的識別、HER-2/neu基因的過表達(dá)、PI3-K/Akt通路的激活、p53功能的缺失、抗凋亡基因bcl-2的過表達(dá)、對細(xì)胞凋亡途徑caspase途徑的干擾等。通過研究，順鉑耐藥的機制不斷被人們發(fā)現(xiàn)。一系列的DNA修復(fù)序列表明鉑類-DNA加合物的移除與人類A2780/C系列卵巢癌順鉑耐藥有關(guān)。Ferry等[22]研究表明核酸切除修復(fù)的增強可導(dǎo)致細(xì)胞株的耐藥，順鉑耐藥被證實與對紫外線抵抗的增強有關(guān)，同時ERCC1的過表達(dá)也與順鉑耐藥有關(guān)，進(jìn)一步表明在順鉑耐藥模型中，ERCC1-XPF核酸內(nèi)切酶是核酸切除修復(fù)的決定性因素。內(nèi)切修復(fù)交叉補體1（excision repair crosscomplementing 1, ERCC1）基因表達(dá)水平與順鉑DNA加合物的修復(fù)有重要關(guān)聯(lián)，有研究報道也與腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥水平有關(guān)。Chang等通過將ERCC1siRNA1和siRNA2轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均被明顯抑制。在HeLa S3細(xì)胞中ERCC1表達(dá)的抑制導(dǎo)致順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)活性的減低。從而為ERCC1siRNA應(yīng)用于治療腫瘤提供了新的發(fā)現(xiàn)[23]。MDR多藥耐藥性仍然是腫瘤化學(xué)治療失敗的主要原因之一，MDR1/P-gp過表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機制。Twist1與頸椎癌放療耐受及化療耐藥有關(guān)，Zhu等[24]研究證實Twist1介導(dǎo)的MDR1/P-gp表達(dá)在頸椎癌細(xì)胞順鉑敏感性起重要作用，Twist1基因的沉默能下調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)。因此通過抑制Twist1表達(dá)來克服頸椎癌藥物耐受可能成為頸椎癌治療的新方法。卵巢癌患者用順鉑治療一段時間后很容易產(chǎn)生對其的耐藥性，Olivero等[25]研究表明肝細(xì)胞生長因子HGF可以增強順鉑治療后卵巢癌細(xì)胞的死亡率。Holford等[26]通過卵巢癌細(xì)胞株體外實驗發(fā)現(xiàn)具有空間位阻效應(yīng)的鉑類復(fù)合物AMD473可以使細(xì)胞逃避順鉑耐藥。

3 MiRNA在腫瘤順鉑耐藥的作用

肺癌是人類最常見腫瘤及死亡原因之一，目前公認(rèn)的晚期非小細(xì)胞肺癌一線治療標(biāo)準(zhǔn)是含鉑的兩藥聯(lián)合方案。以鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素或靶向化療藥物等方案被證實具有較好的療效[27]。然而在使用順鉑化療過程中，易產(chǎn)生順鉑耐藥性，從而為肺癌患者化療提出了難題。人們也在不斷研究順鉑耐藥機制并尋找克服或逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的方法。如Meng等[28]發(fā)現(xiàn)新城疫病毒NDV通過caspase途徑可以誘導(dǎo)耐藥肺腺癌細(xì)胞A549/DDP的凋亡，特別是caspase-9途徑。同時MAPK通路及Akt途徑也參與凋亡誘導(dǎo)過程。通過小鼠A549/DDP肺癌模型證實NDV有溶瘤作用。該研究從體外和體內(nèi)試驗研究表明NDV可以克服肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥。其中關(guān)于miRNA與肺癌順鉑耐藥性的研究也很多。Galluzzi等[29]利用芯片技術(shù)來篩選人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP中表達(dá)上調(diào)的miRNA。人工合成的靶向作用于miR-181a和miR-630的miRNA抑制劑作用于A549/DDP細(xì)胞后，pre-miR-181a和pre-miR-630表達(dá)增加，CDDP引發(fā)的細(xì)胞死亡減少。premiR-181a和pre-miR-630調(diào)節(jié)體內(nèi)凋亡的線粒體/線粒體后途徑，包括Bax寡聚核苷酸化、線粒體膜溶解、成熟的caspase-9和caspase-3的蛋白水解。另外，pre-miR-630阻斷上游由于DNA損傷而引發(fā)繼而引起p53激活的信號傳導(dǎo)通路。該研究表明miR-181a和miR-630可以作為非小細(xì)胞肺癌對順鉑化療的新型調(diào)節(jié)劑。

4 肺癌中miRNA的研究進(jìn)展

MiRNA促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移。O'Donnell等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-17-92與小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的癌基因c-Myc相關(guān)，c-Myc基因過表達(dá)引起了miR-17-92的高表達(dá)。miR-17-92能加快癌細(xì)胞的生長，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不清楚，根據(jù)對其靶點預(yù)測其機制可能是通過抑制兩個抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homolog）和Rb2而發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤作用。miR-21的靶點已被證明是多個腫瘤抑制基因的mRNA，包括PTEN、PDCD（programmed cell death）、TPM1（tropomyosin 1）和SerpinB5（serpin peptidase inhibitor, clade B member 5）基因，這些基因不僅對癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化起負(fù)調(diào)控作用，而且能夠抑制細(xì)胞運動和侵襲[31-34]。

MiRNA抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。let-7 miRNA家族是典型的具有抑癌作用的分子，其表達(dá)水平在多種腫瘤中明顯下調(diào)，Ras和Myc的mRNA 3'UTR區(qū)有多個let-7結(jié)合位點，let-7靶向結(jié)合在其上導(dǎo)致翻譯抑制，從而負(fù)向調(diào)控二者的表達(dá)；相反，let-7的減少必然導(dǎo)致相應(yīng)蛋白的過表達(dá)，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[35]。miR-125b-1定位于11q23-24雜合型缺失（loss of heterozygosity, LOH）的微小區(qū)域，這一區(qū)域在肺部腫瘤、乳腺癌和卵巢癌中存在突變或缺失，提示miR-125b-1發(fā)揮了抑癌基因的作用。有研究表明，肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者的臨床病理特征相關(guān)，且該基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在正相關(guān)，表明miR-125b-1功能異常能增加患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險性，從而可能在肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[18]。

MiRNA調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。Korpal等[36]報道，下調(diào)miR-200c表達(dá)可促進(jìn)EMT發(fā)生，提高腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力；而過表達(dá)miR-200c可抑制EMT發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞侵襲力。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transition, EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。通過EMT，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性以及與基底膜連接等上皮表型，獲得了具有較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)等能力的間質(zhì)表型。EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。

針對腫瘤患者循環(huán)系統(tǒng)中miRNA的研究已經(jīng)開始，為研究肺癌轉(zhuǎn)移過程中miRNA的作用開辟了一條新的道路。Rabinowits等[37]發(fā)現(xiàn)肺癌病人血液循環(huán)中的總腫瘤外切體和miRNAs水平與正常人有明顯的不同，然而肺癌患者與健康人之間血液循環(huán)中的miRNA外切體及具有促腫瘤形成的miRNA種類相類似。提示可以將血液循環(huán)中的miRNA外切體作為肺腺癌的篩選試驗。

5 MiRNA的前景展望

MiRNA可調(diào)控約三分之一的蛋白編碼基因的表達(dá)，影響著多條信號傳導(dǎo)通路。miRNA在不同腫瘤組織中表達(dá)水平的研究和分析，不僅有利于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，更為腫瘤的診斷和治療提供了理論依據(jù)。隨著對miRNA與腫瘤耐藥性的研究進(jìn)展及發(fā)現(xiàn)，以miRNA為靶點設(shè)計新的藥物將為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后提供有效的治療途徑。