魏 霜 袁俊杰 程文杰 林利平 李小健* 鄞杰平 黃錦炎 劉碧琳 劉曉瑩

（1.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515041；2.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局；3.湖北省咸寧市園林綠化管理局）

1 前言

蘭花是蘭科蘭屬中一些多年生草本植物的統(tǒng)稱(chēng)，主要種類(lèi)有春蘭、惠蘭、建蘭、墨蘭、寒蘭等，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)是野生蘭花資源大國(guó)，約有173屬1200多種和大量的變種等。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，以出口蘭花生產(chǎn)為主的產(chǎn)業(yè)悄然興起，蘭花出口數(shù)量增長(zhǎng)迅速，主要貿(mào)易種類(lèi)有蝴蝶蘭、大花蕙蘭等。由于在口岸檢疫中，蘭花品種的鑒定非常重要，而傳統(tǒng)分類(lèi)的依據(jù)是形態(tài)學(xué)特征，存在主觀意識(shí)，極易影響分類(lèi)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展為蘭花的分類(lèi)研究開(kāi)辟了新途徑，對(duì)縮短檢疫鑒定時(shí)間、防止優(yōu)良物種資源的流失等具有重要意義。

本文針對(duì)主要分子標(biāo)記技術(shù)及其衍生技術(shù)在蘭花分類(lèi)（種以下）中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，分析各個(gè)技術(shù)的應(yīng)用情況及優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)作為口岸實(shí)驗(yàn)室蘭花分類(lèi)的一個(gè)重要補(bǔ)充提出展望。

2 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是以個(gè)體間DNA堿基序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，相比其他遺傳標(biāo)記而言具有不受環(huán)境、組織類(lèi)別、發(fā)育階段等方面影響的優(yōu)點(diǎn)，而且多態(tài)性高、數(shù)量多，可作為形態(tài)學(xué)分類(lèi)的一個(gè)重要補(bǔ)充。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種。按照傳統(tǒng)以檢測(cè)手段分類(lèi)，大致可分為4大類(lèi)型：以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)、以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)、以PCR技術(shù)與限制性酶切技術(shù)結(jié)合和基于單核苷酸多態(tài)性[1]；按照Andersen等[2]根據(jù)其基因組來(lái)源不同，可分為3類(lèi)：隨機(jī)分子標(biāo)記（Random DNA markers,RDMs）、目的基因分子標(biāo)記（Gene-targeted markers,GTMs）和功能性分子標(biāo)記（Functional markers,FMs）。主要的分子標(biāo)記包括：限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism,RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat,SSR）、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms,SNP）等。目前，這些分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蘭花的遺傳標(biāo)記中，對(duì)蘭花的分類(lèi)鑒定起到了重要作用。

3 主要分子標(biāo)記技術(shù)

3.1 RFLP

作為第一代分子標(biāo)記技術(shù)的代表，RFLP已被廣泛應(yīng)用于多種生物學(xué)科的研究，它主要是利用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組DNA酶切后電泳轉(zhuǎn)膜，然后利用探針雜交。在植物遺傳標(biāo)記應(yīng)用中，RFLP遍布低拷貝編碼序列，而且其標(biāo)記結(jié)果非常穩(wěn)定，但檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、成本高，目前很少學(xué)者將其用于蘭花的分類(lèi)標(biāo)記，多數(shù)與PCR聯(lián)用降低檢測(cè)成本和周期。蹇黎等[3]利用PCR-RFLP針對(duì)21個(gè)蘭花葉綠體基因和線(xiàn)粒體基因進(jìn)行分析，其結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)基本吻合，證明該方法對(duì)蘭花的分類(lèi)具有輔助作用。雖然RFLP作為經(jīng)典分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)果準(zhǔn)確性高，但其缺點(diǎn)限制了大規(guī)模使用。將RFLP與PCR技術(shù)聯(lián)用后可明顯改善其缺點(diǎn)，但依然需要PCR擴(kuò)增、多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切、凝膠電泳這3個(gè)步驟，操作比較繁瑣，應(yīng)用范圍不廣。

3.2 RAPD及其衍生技術(shù)

RAPD是由Williams等[4]于1990年開(kāi)發(fā)的一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，它以人工合成的隨機(jī)引物（通常為10個(gè)堿基）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析結(jié)果。相對(duì)于RFLP，RAPD大大減少了工作量。國(guó)外大量應(yīng)用實(shí)例均證明RAPD適合于蘭花遺傳分析[5-6]；在國(guó)內(nèi)，梁紅建等[7]最早利用RAPD對(duì)19個(gè)中國(guó)蘭花進(jìn)行瓶中鑒定和分類(lèi)研究，發(fā)現(xiàn)RAPD的分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的結(jié)果基本相符，表明該技術(shù)適用于蘭花的分類(lèi)鑒定；此后，大量學(xué)者利用RAPD對(duì)叉唇蝦脊蘭[8]、蝴蝶蘭[9]、秦嶺野生蕙蘭[10]等蘭花品種進(jìn)行分析，均認(rèn)為RAPD對(duì)蘭花分類(lèi)具有一定的指導(dǎo)意義。雖然RAPD在可重復(fù)性上存在問(wèn)題，但操作便捷、同一實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)果可比性等優(yōu)點(diǎn)，使其依然成為傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)外的重要補(bǔ)充。

RAPD是基于隨機(jī)引物擴(kuò)增來(lái)分析多態(tài)性，引物的Tm值低導(dǎo)致PCR的重復(fù)性差。針對(duì)這一問(wèn)題，Li等[11]于2001年開(kāi)發(fā)了相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism,SRAP）技術(shù)，該技術(shù)設(shè)計(jì)了獨(dú)特的引物對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)它們之間的間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。相對(duì)于RAPD，SRAP增強(qiáng)了特異性，而且產(chǎn)生的片段在需要時(shí)可以克隆測(cè)序，目前國(guó)內(nèi)已有學(xué)者將其用于蘭花的遺傳分析，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化[12]；蹇黎等[13]利用SRAP對(duì)37個(gè)中國(guó)寒蘭和14個(gè)日本寒蘭品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明51個(gè)品種可劃分為中國(guó)寒蘭和日本寒蘭兩大類(lèi)群，證明該技術(shù)適用于蘭花植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究；Cai等[14]人對(duì)7種瀕危蘭花用17條SRAP引物進(jìn)行分析，共產(chǎn)生231條清晰條帶，其中有187條多態(tài)性條帶，結(jié)果表明SRAP適用于蘭花遺傳標(biāo)記；在SRAP的基礎(chǔ)上，Hu等[15]開(kāi)發(fā)了靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（Target region amplified polymorphism,TRAP）技術(shù)，通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)引物的設(shè)計(jì)來(lái)獲得更高的多態(tài)性和可重復(fù)性，但該技術(shù)目前尚未在蘭花遺傳分析中應(yīng)用。

3.3 AFLP

針對(duì)RAPD可重復(fù)性差這一問(wèn)題，Zabeau等[16]于1992年開(kāi)發(fā)了AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，它將基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶酶切后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AFLP綜合了RFLP的可靠性和RAPD的高效性，國(guó)內(nèi)學(xué)者利用其對(duì)春劍[17]、中國(guó)墨蘭[18]、春石斛[19]等蘭花品種進(jìn)行了分析，均獲得較好效果。AFLP雖然不如RAPD簡(jiǎn)便，但相對(duì)于RFLP大大減少了工作量，而且結(jié)果可重復(fù)性高，目前應(yīng)用較為廣泛。

3.4 SSR及其衍生技術(shù)

SSR技術(shù)主要過(guò)程是根據(jù)重復(fù)序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳產(chǎn)物大小來(lái)判斷重復(fù)次數(shù)，目前親子鑒定一般采取該方法。SSR有許多優(yōu)點(diǎn)，包括所需DNA量少、能夠鑒別雜合子和純合子等，但采用時(shí)必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列以設(shè)計(jì)引物，這導(dǎo)致其開(kāi)發(fā)難度較大，目前SSR已經(jīng)被用于蘭花的遺傳標(biāo)記，Moe等[20]開(kāi)發(fā)了14個(gè)新的SSR位點(diǎn)引物并用于分析96個(gè)蘭花品種，結(jié)果顯示建立的SSR方法能夠應(yīng)用于蘭花的遺傳分析；國(guó)內(nèi)也有學(xué)者開(kāi)發(fā)了一系列SSR位點(diǎn)用于蘭花遺傳分析[21-22]。SSR雖然開(kāi)發(fā)難度大，但一旦開(kāi)發(fā)后可以在不同實(shí)驗(yàn)室共享，這對(duì)全世界蘭花資源的不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)對(duì)比和統(tǒng)一分析極具意義，而且該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多重PCR檢測(cè)，提高分析通量和自動(dòng)化程度，這也將是未來(lái)分子生物實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要趨勢(shì)。

有學(xué)者對(duì)SSR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags,EST）來(lái)源的ESTSSR技術(shù)。該技術(shù)與SSR的區(qū)別在于前者來(lái)源于基因組編碼區(qū)，因此更能夠反映植物基因組功能的信息，而且EST-SSR具有在植物物種之間可轉(zhuǎn)移性的優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)難度低于SSR，目前已被應(yīng)用于蘭花的分子標(biāo)記。Huang等[23]利用EST-SSR對(duì)103種栽培中國(guó)蘭花進(jìn)行了分析；也有學(xué)者針對(duì)蝴蝶蘭已公布的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR分析挖掘[24]，但相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)其開(kāi)發(fā)依然較為匱乏。隨著關(guān)于蘭花EST數(shù)據(jù)的不斷更新，大量數(shù)據(jù)會(huì)提供更多的SSR信息，這將為EST-SSR技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供有利條件，從而使其得到廣泛應(yīng)用。

開(kāi)發(fā)難度較大限制了SSR的應(yīng)用，為了克服該缺點(diǎn)，Zietkeiwitcz等[25]在SSR基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單重復(fù)序列間多態(tài)性（Inter simple sequence repeat,ISSR）技術(shù)，其主要優(yōu)點(diǎn)在于不需要知道重復(fù)序列兩端的序列，這對(duì)于一些遺傳研究背景較少的物種非常有利。ISSR的開(kāi)發(fā)費(fèi)用較低，其引物類(lèi)似于隨機(jī)引物，可以在不同的物種間通用。因操作簡(jiǎn)便，已有大量學(xué)者將其應(yīng)用于蘭花的遺傳學(xué)分析中，但不同蘭花品種須建立各自?xún)?yōu)化的反應(yīng)條件。

3.5 SNP

SNP是指在基因組上因單個(gè)核苷酸的變異包括置換、缺失、插入和顛換而形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量多、多態(tài)性高，目前已經(jīng)證明其與人體表型差異、疾病等方面密切相關(guān)。目前，SNP在植物的研究中仍處于起步階段，除了少數(shù)幾種植物如水稻、玉米和擬南芥有較深入的研究外，其他植物研究較少，但其應(yīng)用潛力不容忽視[26]。

3.6 其他衍生技術(shù)

有許多在上述分子標(biāo)記基礎(chǔ)上衍生出來(lái)的技術(shù)，如結(jié)合了RAPD和SSR技術(shù)的隨機(jī)微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)DNA（Random microsatellite amplify polymorphic DNA，RMAPD）[27]，能通過(guò)幾對(duì)引物的擴(kuò)增，獲得清晰、穩(wěn)定的條帶，且操作快速、簡(jiǎn)便。RMAPD使蘭屬親緣關(guān)系的分析更為迅速有效[28]，目前已被成功應(yīng)用于蘭屬植物間的親緣關(guān)系分析，12對(duì)引物所產(chǎn)生的特異性譜可區(qū)分16種蘭屬植物。結(jié)合了RFLP和SSR技術(shù)的數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（Variable number of tandem repeats,VNTR）[29]，同樣已被用于蘭花的遺傳分析[30]。賈琳等[31]將直接擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Direct amplification of length polymorphisms,DALP）應(yīng)用于蓮瓣蘭的遺傳多樣性研究，5個(gè)引物組合共檢測(cè)到103個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。李亞等[32]綜述了核rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer,ITS）分子標(biāo)記在蘭科植物中的應(yīng)用，雖然有些蘭科植物由于遺傳變異等原因在rDNA ITS區(qū)域差異較小，不能進(jìn)行有效區(qū)分，但隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，它必將成為蘭科植物資源鑒定的一種重要方法。

4 討論

以上各種技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，許多學(xué)者對(duì)它們進(jìn)行了對(duì)比。Garcia等[33]為了尋找對(duì)玉米多樣性研究最有效的分子標(biāo)記方法，利用RAPD、RFLP、AFLP和SSR 4種技術(shù)對(duì)18種玉米進(jìn)行分析，綜合結(jié)果認(rèn)為AFLP是玉米指紋圖譜和多樣性分析的最佳方法；Powell等[34]于1996年報(bào)道當(dāng)時(shí)4大分子標(biāo)記技術(shù)的綜合效用大小順序?yàn)锳FLP、SSR、RAPD、RFLP；王慧中等[35]利用RAPD和AFLP技術(shù)分析了蘭屬14種植物的遺傳多樣性，結(jié)果顯示雖然兩種標(biāo)記技術(shù)所得數(shù)據(jù)有所差別，但分析結(jié)果基本一致。無(wú)論是蘭花還是其他植物，學(xué)者們都認(rèn)為AFLP技術(shù)的綜合效用最佳。當(dāng)然，在各個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上也都產(chǎn)生了一些衍生技術(shù)，這些衍生技術(shù)繼承了原技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，在一定程度上解決了原技術(shù)的缺點(diǎn)，具有重要的實(shí)用價(jià)值，但是各個(gè)技術(shù)的側(cè)重點(diǎn)不同，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適技術(shù)。

目前對(duì)蘭花的遺傳學(xué)分析上大多數(shù)利用RAPD技術(shù)，在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用該技術(shù)既方便結(jié)果又具有可比性，確為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部對(duì)蘭花分類(lèi)鑒定的一個(gè)重要補(bǔ)充方法。但從宏觀上來(lái)看，蘭花資源豐富，遍布全世界，這些資源必然需要利用分子標(biāo)記方法分類(lèi)整合在一起才有利于蘭花資源的開(kāi)發(fā)，因此，不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可對(duì)比性顯得尤為重要，技術(shù)的可重復(fù)性必將是分子標(biāo)記技術(shù)中一個(gè)非常重要的方面。曾經(jīng)在一段時(shí)間內(nèi)，由于當(dāng)時(shí)已有物種基因序列的數(shù)據(jù)量缺乏，SSR及其衍生技術(shù)陷入瓶頸期，但由于第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，各個(gè)物種核酸序列大量增加，這些可以直接分析利用的數(shù)據(jù)極大地推動(dòng)了SSR的發(fā)展[36]；另外多重PCR、毛細(xì)管電泳等技術(shù)與SSR相結(jié)合提高了檢測(cè)的通量和檢測(cè)靈敏度，讓一次檢測(cè)分析多個(gè)位點(diǎn)成為可能，使分析結(jié)果更為準(zhǔn)確。SNP作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，具有極大的應(yīng)用潛力。

在口岸實(shí)驗(yàn)室中，分子標(biāo)記技術(shù)作為補(bǔ)充用于蘭花分類(lèi)時(shí)，對(duì)技術(shù)的簡(jiǎn)便性要求很高，RAPD和ISSR非常適合于這一要求。目前尚無(wú)一種分子標(biāo)記技術(shù)能夠達(dá)到理想分子標(biāo)記的要求，所以有學(xué)者針對(duì)現(xiàn)有分子標(biāo)記技術(shù)存在的優(yōu)缺點(diǎn)，提出將多種分子標(biāo)記技術(shù)同時(shí)應(yīng)用，以便進(jìn)行全面分析。例如Xue等[42]人就將RAPD和SRAP兩種技術(shù)聯(lián)用以分析鉤狀石斛和鐵皮石斛，使結(jié)果更為準(zhǔn)確。因此，多種簡(jiǎn)單技術(shù)聯(lián)用將是口岸實(shí)驗(yàn)室對(duì)蘭花輔助鑒定的一個(gè)重要方向。

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