方紅

·專論·

皮膚微生態(tài)的研究進(jìn)展

方紅

皮膚微生態(tài)學(xué)是研究皮膚微生物群的結(jié)構(gòu)、功能及其與人體相互關(guān)系的一門生態(tài)學(xué)科,即皮膚的細(xì)胞水平和分子水平的生態(tài)學(xué),它是微生態(tài)學(xué)的一個(gè)分支［1］。皮膚是人體內(nèi)外環(huán)境交界的一個(gè)生物活性界面,皮膚的生態(tài)環(huán)境為微生物群的定居和繁衍提供了一個(gè)很好的場(chǎng)所。30年前已有相關(guān)研究顯示［2］,皮膚表面棲居著大量的微生物群,包括細(xì)菌、真菌、病毒、衣原體和某些原蟲等,它們與人類在共同的歷史進(jìn)化過程中形成了獨(dú)特的生態(tài)結(jié)構(gòu),稱之為皮膚正常微生物群。以往曾認(rèn)為它們是“無用的”,甚至是“致病的”,近年來隨著研究手段和方法的不斷進(jìn)展更新,尤其是微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展,宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,使得人們改變了傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí),對(duì)皮膚的正常微生物群與宿主、環(huán)境之間的生態(tài)體系即皮膚微生態(tài)有了深入的了解。

一、概述

皮膚微生態(tài)的研究顯示,皮膚常駐菌具有占位保護(hù)作用,有層次有序地定植在皮膚上,猶如一層生物屏障,使致病菌及外籍菌無法立足于皮表;多達(dá)20%的常駐菌可產(chǎn)生抑制病原菌的化合物。如革蘭陽性共生菌,包括乳酸菌、鏈球菌、葡萄球菌可產(chǎn)生殺菌素,表皮葡萄球菌可產(chǎn)生一種抗菌肽酚可溶性調(diào)控蛋白(phenol soluble modulin，PSM),對(duì)金黃色葡萄球菌、A組鏈球菌、大腸桿菌具有選擇性殺滅作用,但不針對(duì)其他表皮葡萄球菌及常駐菌［1，3］;常駐菌可分解皮脂甘油三酯為脂肪酸,形成乳化皮脂膜,既對(duì)自身及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)作用,又可防止皮表水分蒸發(fā),由于呈弱酸性可抑制一些化膿菌及皮膚癬菌的定植;一些暫駐菌中的機(jī)會(huì)致病菌作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),促進(jìn)免疫器官發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［2］。相關(guān)研究顯示對(duì)皮膚致病菌的保護(hù)性免疫有依賴于皮膚正常微生物群而非腸道微生物群［4］。

正常皮膚每平方厘米定居著大約100萬細(xì)菌,有上百種的類型,用傳統(tǒng)的皮膚拭子和活檢標(biāo)本培養(yǎng),在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下能培養(yǎng)到的細(xì)菌真菌等尚不及1%,而且許多細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)會(huì)被生長(zhǎng)更快的微生物群超過,其結(jié)果只能得到易培養(yǎng)的細(xì)菌或真菌種群,如葡萄球菌和馬拉色菌等［5］。因此,單靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法,存在許多難以克服的缺陷和不足,人們無法對(duì)皮膚微生態(tài)進(jìn)行深入研究。

二、宏基因組學(xué)的發(fā)展開拓了人們對(duì)皮膚微生態(tài)學(xué)研究的新思路

宏基因組學(xué)(metagenomics)又稱微生物環(huán)境基因組學(xué),是1988年由Handelsman等率先提出的［5］,為免培養(yǎng)直接提取特定生境中全部微生物(包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng))的總DNA,對(duì)微生物群的基因總和進(jìn)行功能基因篩選和(或)測(cè)序分析的一種新的應(yīng)用學(xué)科。它包括下列4個(gè)步驟,即生態(tài)區(qū)樣本中微生物群總DNA提取,宏基因文庫構(gòu)建,序列測(cè)定分析以及功能基因篩選鑒定。分析細(xì)菌微生物群的方法包括擴(kuò)增原核生物的小亞基核糖體RNA(rRNA)和用PCR直接擴(kuò)增來自皮膚樣本的基因。16SrRNA基因存在于所有的細(xì)菌和古生菌,包括保守區(qū)域作為PCR引物的結(jié)合點(diǎn),可變區(qū)域用于PCR產(chǎn)物的高通量測(cè)序后的系統(tǒng)分類。將＞97%相同的序列歸為一個(gè)操作分類單元(operational taxonomy unit,OTU)。在一個(gè)物種中,序列的差異被假設(shè)為是種內(nèi)的種屬變化。在1個(gè)物種中,序列的數(shù)量代表這個(gè)種屬在生態(tài)區(qū)樣本中的相對(duì)豐度。宏基因組學(xué)方法通過對(duì)所存在的種屬鑒別及其相對(duì)豐富度,可提供皮膚微生態(tài)正常細(xì)菌群落的全景象圖。對(duì)于真菌生物通常選擇18SrRNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行真菌通用引物的PCR擴(kuò)增。

采用宏基因組學(xué)方法,研究者們已著手對(duì)皮膚不同生態(tài)區(qū)的微生物群的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互作用以及與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行分析研究。

(一)建立皮膚正常微生物群數(shù)據(jù)庫:2007年,美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院采用宏基因組學(xué)方法啟動(dòng)了人類微生物組對(duì)242例健康成年人的微生物含量的研究計(jì)劃,最近公布了人類微生物基因序列的參考目錄,包括整個(gè)基因組及16SrRNA基因序列的數(shù)據(jù)庫［5］。通過該項(xiàng)系列研究及近10年的相關(guān)研究,人們較為全面地了解了健康人群的皮膚微生物組群在不同的空間、時(shí)間和個(gè)體變化。人們發(fā)現(xiàn)人類皮膚在胚胎期宮內(nèi)環(huán)境中是無菌的,但由于人類生存在一個(gè)充滿微生物的環(huán)境中,出生后的幾天內(nèi),新生兒皮膚表面很快出現(xiàn)細(xì)菌等微生物,最初定植較為簡(jiǎn)單的低多樣性微生物,如早期以葡萄球菌為主,在生后第一年其數(shù)量顯著下降有助于增加其他細(xì)菌的定植。嬰幼兒皮膚以厚壁菌為主。隨著皮膚的功能、結(jié)構(gòu)的持續(xù)完善,不同部位的皮膚由于濕度、溫度和腺體分泌的不同出現(xiàn)越來越多樣性的微生物群,且隨年齡的增長(zhǎng)、不同環(huán)境的接觸、不同的遺傳背景而發(fā)生一些改變。

最近一項(xiàng)研究對(duì)28名2～40歲的健康人皮膚正常菌群進(jìn)行了評(píng)估［6］。結(jié)果顯示,兒童各部位皮膚細(xì)菌群落與成人有明顯不同,最為顯著的改變是在鼻孔,兒童以厚壁菌門(鏈球菌),擬桿菌,變形桿菌占優(yōu)勢(shì),成人則以棒狀桿菌屬和丙酸桿菌屬占優(yōu)勢(shì),兒童鼻孔可以隱藏更多的潛在的致病菌種,如金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌。隨著年齡的增長(zhǎng),到青春期后,會(huì)被親脂性的細(xì)菌和其他細(xì)菌如表皮葡萄球菌所替代,這或許可解釋特應(yīng)性皮炎患者在青春期后病情會(huì)明顯減輕。

利用16SrRNA測(cè)序的宏基因組學(xué)研究顯示,成人皮膚菌群和腸道菌群的絕大多數(shù)可分為4個(gè)門:放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門,在這些門中存在上千種特殊種類。例如,一項(xiàng)關(guān)于51位健康志愿者手掌微生物的研究顯示,有4 742種特殊類型,平均一個(gè)手掌上有158種類型［7］。

新近研究發(fā)現(xiàn),正常皮膚微生物群不僅存在皮膚表面,在真皮層和脂肪層組織以往一直認(rèn)為是無菌的也能檢測(cè)到細(xì)菌,這些皮膚的正常共生菌與基底膜下方的宿主細(xì)胞之間進(jìn)行相互接觸、信息交流［8］。有研究［9］表明,如在人生早期階段,及時(shí)建立正常皮膚微生物群對(duì)于阻止外來感染性微生物的入侵起到了舉足輕重的作用,有助于建立皮膚的穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),并可顯著影響皮膚免疫功能的發(fā)育。盡管正常皮膚微生物群在不同個(gè)體或同一個(gè)體的不同部位之間存在差異,但與皮膚處于一個(gè)相對(duì)平衡狀態(tài)［10］。

對(duì)20個(gè)不同皮膚生態(tài)區(qū)的微生物研究顯示,相似的生態(tài)環(huán)境如腋下和腘窩有相似的微生物構(gòu)成。所有個(gè)體,痤瘡丙酸桿菌在皮脂腺豐富的生態(tài)區(qū),如前額、耳后皺褶處和背部占優(yōu)勢(shì)。葡萄球菌和棒狀桿菌則在潮濕的部位如腋窩占優(yōu)勢(shì)。

除了不同的物種組成,每個(gè)生態(tài)區(qū)有其特有水平的微生物群多態(tài)性和暫時(shí)性的波動(dòng)。例如,不同受試者的肘窩在物種構(gòu)成上有很高的多態(tài)性,稱之為β多態(tài)性。但對(duì)于同一個(gè)體的肘窩卻很少有多態(tài)性,稱為α多態(tài)性。研究者發(fā)現(xiàn)將微生物群從一個(gè)棲息地移植到另一個(gè)棲息地,如從舌部移到前額,這些舌部的微生物群僅短暫地出現(xiàn)在前額,最終又恢復(fù)到前額的微生物群。

人類皮膚任何生態(tài)區(qū),除了最為豐富的丙酸桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌三大屬以外,大部分微生物的種屬構(gòu)成少于總菌群的1%。這些少數(shù)的物種以往未能得以很好的認(rèn)識(shí),且以往的研究方法人們也無法知道其在皮膚定植。如以前認(rèn)為革蘭陰性微生物很少定植在皮膚,但采用宏基因組學(xué)方法研究者發(fā)現(xiàn)干燥的皮膚生態(tài)區(qū)如前臂或腿部,也有著豐富的革蘭陰性微生物群。這些低豐度的物種不僅被發(fā)現(xiàn),有些可能是皮膚生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵菌群［11］。

(二)正常微生物菌群結(jié)構(gòu)改變與皮膚病的關(guān)系:

1.痤瘡:最近Fitz-Gibbon等利用宏基因組學(xué)和基因測(cè)序相結(jié)合方法［12］,在菌株水平和基因水平比較了49例痤瘡患者和50例健康人鼻部皮脂腺單元的皮膚微生物群。他們將每個(gè)樣本的16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)約400個(gè)克隆測(cè)序,平均分析了311個(gè)幾乎全長(zhǎng)的16SrDNA序列,比較了71個(gè)基因組,發(fā)現(xiàn)痤瘡患者和健康人鼻部痤瘡桿菌的相對(duì)豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,核糖體型1(RT1)和RT2、RT3痤瘡丙酸桿菌菌株相當(dāng)均勻地分布于痤瘡患者和健康人鼻部。但痤瘡患者中RT4和RT5痤瘡丙酸桿菌的菌株占優(yōu)勢(shì),RT6菌株則主要見于正常人群的鼻部。提示RT4和RT5痤瘡丙酸桿菌菌株與痤瘡的發(fā)病密切相關(guān),RT6菌株則與健康皮膚相關(guān)。該項(xiàng)研究從菌株水平分析了共生菌痤瘡丙酸桿菌的不同菌株在痤瘡發(fā)病中的作用。這給人們帶來啟發(fā),今后痤瘡的治療有必要采用微生態(tài)制劑來調(diào)節(jié)皮膚微生物群使其回到健康的菌群結(jié)構(gòu)狀態(tài),即進(jìn)行自然共生菌結(jié)構(gòu)的靶向治療,而非采用抗生素來殺滅所有的痤瘡丙酸桿菌。

2.特應(yīng)性皮炎:特應(yīng)性皮炎是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,在美國(guó)大約15%兒童發(fā)病,通常認(rèn)為其病理機(jī)制包括表皮絲聚合蛋白缺陷所致的屏障功能受損,金黃色葡萄球菌定植和免疫超敏反應(yīng)。用培養(yǎng)方法可確定金黃色葡萄球菌定植和感染常與其發(fā)病相關(guān)。因而經(jīng)驗(yàn)性治療措施包括采用抗生素和類固醇激素。宏基因組學(xué)研究［13］顯示,在AD的發(fā)作期金黃色葡萄球菌比基線時(shí)或治療后要明顯增多,并與疾病的嚴(yán)重度密切相關(guān)。治療后鏈球菌屬、丙酸菌屬、棒狀桿菌屬增加。但令人驚訝的是,急性發(fā)作期金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均增加,葡萄球菌物種從35%增加到90%,且與發(fā)病無關(guān)的非葡萄球菌在豐度上也發(fā)生改變。進(jìn)一步的研究顯示,表皮葡萄球菌可產(chǎn)生一些細(xì)胞因子如,PSM選擇性地抑制金黃色葡萄球菌,雖然目前還無法解釋表皮葡萄球菌的增加是為了拮抗金黃色葡萄球菌還是由于與金黃色葡萄球菌相互作用促進(jìn)彼此定植。但這一結(jié)果提示特應(yīng)性皮炎的發(fā)病可能與皮膚正常微生物群的結(jié)構(gòu)改變和失衡有關(guān)。

3.銀屑病:Fahlén 等［14］采用宏基因組學(xué)方法研究10例銀屑病患者皮損(活檢標(biāo)本)處菌群結(jié)構(gòu)變化并與12例正常人皮膚進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,銀屑病患者軀干部皮損變形菌的比例較健康人皮膚明顯增加(分別占52%和32%,P=0.0113);銀屑病皮損中鏈球菌屬占32%,而健康對(duì)照為26%;另外皮損中葡萄球菌和丙酸桿菌含量則顯著低于健康人皮膚。這項(xiàng)研究提示,銀屑病皮損其菌群結(jié)構(gòu)有別于健康人皮膚。這些差異是否是導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的病因還是繼發(fā)于銀屑病的病理改變而改變,尚待研究。

三、結(jié)語

皮膚的微生物群可能通過我們意想不到的方式對(duì)人體的生理和疾病產(chǎn)生影響,動(dòng)態(tài)平衡機(jī)體的免疫應(yīng)答,需要我們對(duì)其變化加以重視?？茖W(xué)家們雖然能夠?qū)⒛撤N疾病與某些微生物的存在或缺乏相聯(lián)系,卻無法將許多疾病的“罪魁禍?zhǔn)住辨i定在某種病原微生物上。事實(shí)上,很可能是多種微生物群落的結(jié)構(gòu)變化起著共同的作用。盡管宏基因組學(xué)方法為我們提供了有效的研究手段,但皮膚微生物群組成結(jié)構(gòu)改變與皮膚病關(guān)系的研究還僅是一個(gè)開端,目前的工作大多局限于對(duì)細(xì)菌菌群的改變,對(duì)其他微生物群的變化了解甚少。皮膚微生態(tài)這一微妙神奇的世界仍然有太多的東西值得人們深入了解。如微生物群是如何影響皮膚的信息儲(chǔ)存和新陳代謝?為何不同個(gè)體同一生態(tài)區(qū)微生物構(gòu)成有所不同?相信隨著皮膚微生態(tài)與皮膚病之間相關(guān)性的深入研究,對(duì)皮膚微生物的調(diào)控有可能成為一種相關(guān)皮膚病的預(yù)防和診治手段。

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2013-10-21)

(本文編輯:吳曉初)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.001

310003杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚性病科

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