馬新華 邵文俊 金宛宛 高宇

斑禿患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液白介素10和轉(zhuǎn)化生長因子β1檢測

馬新華 邵文俊 金宛宛 高宇

目的探討CD4+CD25+T細(xì)胞與斑禿發(fā)病之間的關(guān)系。方法收集了3組研究對象,其中健康對照組25例、穩(wěn)定期斑禿患者25例、進(jìn)展期斑禿患者23例。抽取所有對象外周血,提取CD4+CD25+T細(xì)胞,培養(yǎng)4 d,收集培養(yǎng)上清液,ELISA法檢測上清液IL-10和TGF-β1水平。結(jié)果進(jìn)展期斑禿患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)的IL-10和TGF-β1分別為(31.68±6.78)pg/ml和(32.29±6.80)pg/ml,明顯低于健康對照組(57.34±14.15)pg/ml、(57.43±15.16)pg/ml和穩(wěn)定期斑禿患者(52.56±13.02)pg/ml和(61.75±14.10)pg/ml(P＜0.05),而健康對照組和穩(wěn)定期斑禿患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CD4+CD25+T細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β1功能降低,在斑禿發(fā)病中有一定意義。

斑禿;轉(zhuǎn)化生長因子β1;白細(xì)胞介素10

斑禿的病因尚不完全清楚,越來越多證據(jù)表明,斑禿是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病［1］。CD4+CD25+T細(xì)胞為具有獨(dú)立功能的T細(xì)胞亞群,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、維持自身免疫耐受功能。其作用機(jī)制是通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制,如:分泌白介素(IL)10及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β發(fā)揮免疫抑制。TGF-β是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子, 目前發(fā)現(xiàn) TGF-β 家族有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,在免疫系統(tǒng)中,主要產(chǎn)生的是TGF-β1［2］。我們檢測斑禿患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10及TGF-β1,探討CD4+CD25+T細(xì)胞在斑禿發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、對象與方法

1.一般資料:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科門診未經(jīng)治療的斑禿患者48例,均為斑片型,病期15 d至7年,其中活動期23例,表現(xiàn)為脫發(fā)斑不斷擴(kuò)大或有新的脫發(fā)斑出現(xiàn),脫發(fā)斑邊緣毛發(fā)牽拉試驗(yàn)陽性,男12例,女11例,年齡7～45歲,平均36.2歲。穩(wěn)定期25例,表現(xiàn)為未見新脫發(fā)斑出現(xiàn)1個月以上,脫發(fā)斑邊緣毛發(fā)牽拉試驗(yàn)陰性,可有少量細(xì)毛長出,男12例,女13例,年齡8～48歲,平均34.8歲。健康對照組為25例健康體檢者,其中男13例,女12例,年齡8～50歲,平均38歲,均無毛發(fā)疾病、免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病。以上3組具有可比性,在年齡及性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),研究對象均簽署知情同意書。

2.實(shí)驗(yàn)試劑:人淋巴分離液、RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司,鼠抗人CD3單克隆抗體、鼠抗人CD28單克隆抗體購自美國BD公司,IL-10、TGF-β1的ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

3.方法:CD4+CD25+T細(xì)胞的分離和培養(yǎng):抽取研究對象肘靜脈血20 ml,獲取1×108個單一核細(xì)胞,加入人CD4+CD25+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒中抗生物素Cocktail,孵育10 min,加入抗生物素微球,孵育15 min,200×g離心10 min。將LD柱子置于MidiMACS分選器中,收獲細(xì)胞。加入抗CD4-F1TC標(biāo)記的抗體,獲取CD4+T細(xì)胞。重懸CD4+T細(xì)胞,每1×l07個細(xì)胞加入10 μl CD25微球,孵育15 min。將MS柱子置于MidiMACS分選器中,加入細(xì)胞懸液,收集CD4+CD25-T細(xì)胞。用含5%胎牛血清、HEPES和L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/ml,植入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔200 μl,實(shí)驗(yàn)組及對照組均加鼠抗人CD3單克隆抗體和鼠抗人CD28單克隆抗體,37℃5%CO2培養(yǎng)4 d,收集上清液。根據(jù)試劑盒說明書,ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-10和TGF-β1水平。

3.統(tǒng)計學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作數(shù)據(jù)處理,3組樣本的CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-10和TGF-β1數(shù)據(jù)采用±s表示,各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

進(jìn)展期斑禿患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞分泌IL-10水平及TGF-β1低于健康對照組,穩(wěn)定期斑禿患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IL-10水平及TGF-β1與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,進(jìn)展期斑禿患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IL-10及TGF-β1水平低于穩(wěn)定期斑禿患者。見表1。

三、討論

初始CD4+T細(xì)胞在不同的條件下可分化成不同亞型的T淋巴細(xì)胞,包括有以CD4+CD25+為特征的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),根據(jù)其來源的不同可將分為天然型Treg和誘導(dǎo)型Treg,前者是以細(xì)胞直接接觸的方式起作用,而后者是以細(xì)胞因子依賴的途徑發(fā)揮作用［3］。Treg細(xì)胞能夠控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度,減輕對機(jī)體組織損傷,在很多自身免疫性疾病中被證實(shí),包括有Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［4-5］等。Treg的主要作用表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性,是外周免疫耐受形成機(jī)制的主要組成部分。其主要作用機(jī)制為分泌抑制性細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β1)、表達(dá)細(xì)胞表面分子(CTLA-4、GITR 等)及 Foxp3 等［6］。IL-10 是一種重要的炎癥抑制因子,通過抑制樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子等機(jī)制來抑制Th1效應(yīng),也能通過抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TGF-β能夠抑制自身免疫反應(yīng),皮膚組織中低水平的TGF-β能降低局部皮膚免疫抑制功能,導(dǎo)致外周耐受被破壞［7］。斑禿的發(fā)病同毛囊的破壞有明顯的關(guān)系,特別是進(jìn)展期的斑禿,而斑禿患者外周血Treg功能及數(shù)量存在異常，這可能是斑禿患者外周血表現(xiàn)之一［8］。本研究通過斑禿患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10和TGF-β1水平,結(jié)果顯示在進(jìn)展期斑禿患者中,水平明顯低于穩(wěn)定期和健康對照組,表明CD4+CD25+T細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子功能降低,和斑禿發(fā)病有一定關(guān)系。穩(wěn)定斑禿患者CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10和TGF-β1未見明顯降低,推測可能免疫抑制功能受損較輕。

表1 3組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液白介素10和轉(zhuǎn)化生長因子β1(±s) pg/ml

表1 3組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液白介素10和轉(zhuǎn)化生長因子β1(±s) pg/ml

注:a:與健康對照組比較(P＞0.05);b:與健康對照組比較(P＜0.05);c:與穩(wěn)定期斑禿比較(P＜0.05)

組別 例數(shù) 白介素10 轉(zhuǎn)化生長因子β1健康對照組 25 57.34±14.15 57.43±15.16穩(wěn)定期斑禿 25 52.56±13.02a 61.75±14.10a進(jìn)展期斑禿 23 31.68±6.78bc 32.29±6.80bc

［1］Cooper GS，Bynum ML，Somers EC.Recent insights in the epidemiology ofautoimmune diseases：improved prevalence estimates and understanding of clustering of diseases ［J］.J Autoimmun，2009，33(3-4)：197-207.

［2］Li MO，F(xiàn)lavell RA.TGF-beta：a master of all T cell trades［J］.Cell，2008，134(3)：392-404.

［3］Bluestone JA，Abbas AK.Natural versus adaptive regulatory T cells［J］.Nat Rev Immunol，2003，3(3)：253-257.

［4］Lawson JM，Tremble J，Dayan C，et al.Increased resistance to CD4+CD25hi regulatory T cell-mediated suppression in patients with type 1 diabetes［J］.Clin Exp Immunol，2008，154(3)：353-359.

［5］Valencia X，Yarboro C，Illei G，et al.Deficient CD4+CD25highT regulatory cell function in patients with active systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2007，178(4)：2579-2588.

［6］Schubert LA，Jeffery E，Zhang Y，et al.Scurfin(FOXP3)acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation ［J］.J Biol Chem，2001，276(40)：37672-37679.

［7］Li MO，Wan YY，Sanjabi S，et al.Transforming growth factor-β regulation of immune responses［J］.Annu Rev Immunol，2006，24：99-146.

［8］陳小敏，楊秀麗，史維平，等.斑禿患者外周血CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的測定［J］.中華皮膚科雜志，2008，41(1)：29-31.

2013-07-08)

(本文編輯:吳曉初)

Detection of interleukin-10 and transforming growth factor-β1 in the culture supernatant of CD4+CD25+T cells from patients with alopecia areata

Ma Xinhua，Shao Wenjun，Jin Wanwan，Gao Yu.Department of Dermatology，Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027，Zhejiang，China

ObjectiveTo evaluate the potential association of CD4+CD25+T cells with alopecia areata.MethodsTotally，this study enrolled 23 patients with progressive alopecia areata，25 patients with stable alopecia areata，and 25 healthy controls.Peripheral blood was isolated from these subjects followed by isolation of CD4+CD25+regulatory T cells，which were then cultured with the presence of anti-CD3 and-CD28 monoclonal antibodies for four days.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay was performed to measure the levels of interleukin(IL)-10 and transforming growth factor(TGF)-β1 in the culture supernatant of these T cells.ResultsThe levels of IL-10 and TGF-β1 were(31.68± 6.78)pg/ml and(32.29 ± 6.8)pg/ml respectively in the culture supernatant of CD4+CD25+regulatory T cells from patients with progressive alopecia areata，significantly lower than those from the healthy controls((57.34±14.15)pg/ml and(57.43±15.16)pg/ml，bothP＜0.05)and patients with stable alopecia areata((52.56 ± 13.02)pg/ml and(61.75 ± 14.10)pg/ml，bothP ＜ 0.05).However，no significant difference was observed in the supernatant levels of IL-10 or TGF-β1 between the healthy controls and patients with stable alopecia areata.ConclusionsThe secretion of IL-10 and TGF-β1 by CD4+CD25+T cells is decreased in patients with progressive alopecia areata，which may contribute to the pathogenesis of alopecia areata.

Alopecia areata；Transforming growth factor beta1；Interleukin-10

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.017

浙江省溫州市科技局對外合作課題(H20100016)

325027溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科

高宇,Email:gaoyu@medmail.com.cnCorresponding author：Gao Yu，Email：gaoyu@medmail.com.cn