焦廣發(fā)，高 峰，王海英，劉 徽，謝永濤，何玉秀△

（1.河北體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系，石家莊050041，2.河北師范大學(xué)體育學(xué)院，石家莊050041）

運(yùn)動(dòng)與攝食活動(dòng)之間的關(guān)系復(fù)雜，一般認(rèn)為中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可刺激攝食活動(dòng)，以補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)中消耗的能量從而維持體重［1］。下丘腦是機(jī)體能量平衡和攝食調(diào)控的中樞，分泌的神經(jīng)肽和神經(jīng)因子參與運(yùn)動(dòng)對(duì)攝食活動(dòng)的調(diào)節(jié)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、成熟過程中發(fā)揮重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)BDNF對(duì)攝食活動(dòng)具有中樞性的調(diào)控作用，BDNF可引起體重下降和攝食減少，因此BDNF也是一種抑食欲因子。BDNF首先合成前體 BDNF（precursor of brain derived neurotrophic factor，pro-BDNF），經(jīng)細(xì)胞外的水解酶剪切成為成熟的BDNF。研究表明，腦內(nèi)BDNF和pro-BDNF受生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)，在大鼠幼齡期變化較為顯著［2］。短期的運(yùn)動(dòng)可使正常體重大鼠和肥胖大鼠海馬內(nèi)BDNF升高［3］。因此，下丘腦中的 BDNF可能在幼齡大鼠攝食活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。目前，有關(guān)幼齡大鼠在發(fā)育過程中進(jìn)行長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)下丘腦內(nèi)BDNF系統(tǒng)的變化和作用機(jī)制尚不清楚，為此進(jìn)行本項(xiàng)工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

清潔級(jí)10周齡SD大鼠（河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào) SCXK冀2008-1-003），按前期方案制備孕鼠［6］，選取3周齡斷乳雄性幼鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。幼鼠用清潔自來水和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料飼養(yǎng)（河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），自由飲水?dāng)z食。飼料由河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度控制在50%±5%，溫度控制在（23±2）℃，自然光照。幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C）和運(yùn)動(dòng)組（E），每組各6只。C組安靜不運(yùn)動(dòng)，E組每天運(yùn)動(dòng)一次。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

游泳運(yùn)動(dòng)方案采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，最初每次30 min，每周增加15min，運(yùn)動(dòng)量增加到60min后每周增加5min，第9周達(dá)到每次90 min。大鼠每天運(yùn)動(dòng)1次，每周運(yùn)動(dòng)6 d，共9周。

1.3 取材

大鼠取材前空腹8 h，停止運(yùn)動(dòng)48 h。腹腔注射0.5%的戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，心臟取血，制備血清，-20℃保存?zhèn)溆?。分離下丘腦，沿正中線分為兩半放入液氮，-80℃保存。

1.4 血清BDNF測(cè)試

血清BDNF采用ELISA法，Wellscan MK2型酶標(biāo)儀測(cè)試，美國(guó)Millipore試劑盒。

1.5 下丘腦組織BDNFmRNA測(cè)試

取右側(cè)下丘腦組織提取總RNA，進(jìn)行完整性分析和含量后，使用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃60 min，70℃ 5min。

引物由上海invitrgoen公司合成。按Takara公司RT-PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，使用Applied Biosystems（ABI 7000）定量PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃，10 s，1 Cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 Cycle。目的基因和引物序列以及擴(kuò)增產(chǎn)物量：BDNF上游引物：GTTCCACCAGGTGAGAAGGG，下 游 引 物：GCCTTCATGCAACCGAAGTAT，擴(kuò)增產(chǎn)物量 75 bp；GAPDH上游引物 CAAGGTCATCCATGACAACTTTG， 下 游 引 物 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG，擴(kuò)增產(chǎn)物量496 bp。

1.6 下丘腦組織BDNF蛋白測(cè)試

取左側(cè)下丘腦組織，液氮研磨，加入裂解液12 000 r／min 4℃離心 10 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入 5×loading buffer 100℃煮沸5 min變性。取30μg蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至NC膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉30 min。分別用 BDNF和 pro-BDNF（4℃，兔多抗，1：100，美國(guó) Santa Cruz公司），GAPDH（4℃，兔多抗，1：10 000）孵育過夜。TBST洗膜3min×5次。二抗室溫孵育（羊抗兔-HRP，1：2 000）40 min。TBST洗膜TBST洗膜3 min×5次，加入ECL發(fā)光液，暗室曝光。UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，以目的蛋白條帶灰度值除以相應(yīng)內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值得出最終結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析。Real-time PCR結(jié)果比較使用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)，其他指標(biāo)不同組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)第1周、第9周攝食量、總攝食量以及體重變化

C組和E組大鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，12周齡時(shí)E組大鼠體重低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組大鼠在運(yùn)動(dòng)第1周和第9周每周攝食量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)實(shí)驗(yàn)期間9周總攝食量也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.2 12周齡大鼠血清BDNF含量以及下丘腦組織BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平

E組和C組大鼠血清BDNF含量和下丘腦BDNFmRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但下丘腦組織pro-BDNF和BDNF蛋白表達(dá)水平E組和C組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，E組均高于C組（P＜0.05，表 2，圖 1）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到幼齡大鼠在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后體重較低，但在運(yùn)動(dòng)的開始階段、運(yùn)動(dòng)的最后階段以及整個(gè)運(yùn)動(dòng)期間大鼠的攝食量沒有變化，說明本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案使幼齡大鼠維持了攝食活動(dòng)的穩(wěn)定。Broom等［4］報(bào)道跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后食欲受到抑制，饑餓感不明顯。盡管游泳運(yùn)動(dòng)可以改變食欲，但在人體的實(shí)驗(yàn)研究中并沒有發(fā)現(xiàn)攝食量的真正增多。運(yùn)動(dòng)引起食欲減退現(xiàn)象一般出現(xiàn)在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，兒童在急性的運(yùn)動(dòng)后攝食也會(huì)減少［5］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可以增加能量支出和食物攝入［6］。本研究結(jié)果提示幼齡大鼠長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)仍維持正常的攝食活動(dòng)，并不因運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)攝食的增多或減少。

Tab.1 BW at3 week-old and 12 week-old and at the first and the ninth exercise week and total FIof rats（g，ˉx±s，n＝6）

Tab.2 Serum BDNF，BDNFmRNA，BDNF and pro-BDNF protein in hypothalamus of rats（ˉx±s，n＝6）

Fig.1 Expression level of pro-BDNF and BDNF protein in hypothalamus of rats by Western blot C：Control group；E：Exercise group；pro-BDNF：Precursor of brain derived neurotrophic factor；BDNF：Brain derived neurotrophic factor；GAPDH：Reference genes

近年來的研究揭示能量支出和食物攝入控制系統(tǒng)的復(fù)雜性，負(fù)責(zé)能量平衡的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。一次遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后下丘腦弓狀核中主要的神經(jīng)遞質(zhì)變化與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激有關(guān)，而6周運(yùn)動(dòng)后神經(jīng)遞質(zhì)的變化會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)［7］。這說明長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)使下丘腦功能產(chǎn)生穩(wěn)定性的變化。Rothman等［8］認(rèn)為BDNF是能量代謝神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和行為活動(dòng)之間的整合因子。本研究中幼齡期長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)大鼠下丘腦BDNFmRNA表達(dá)水平?jīng)]有變化，但pro-BDNF和成熟的BDNF蛋白表達(dá)水平均升高。

成熟的BDNF與pro-BDNF都具有生物學(xué)活性，但生物學(xué)活性作用存在差異，Pro-BDNF與成熟的BDNF功能和作用完全相反，并且BDNF的不足或不平衡導(dǎo)致精神及行為的改變［9］。因此，本研究中長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)大鼠在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)攝食活動(dòng)沒有變化與BDNF和pro-BDNF同時(shí)升高有關(guān)，推測(cè)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)引起B(yǎng)DNF升高的食抑制食欲作用與pro-BDNF升高產(chǎn)生的促食欲作用相互抵消。轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可以引起大鼠腦內(nèi)多個(gè)區(qū)域BDNF在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，但BDNF的轉(zhuǎn)錄水平升高只發(fā)生在運(yùn)動(dòng)后幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)［10］。結(jié)合本研究中 BDNFmRNA的變化，說明長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)更可能影響幼齡大鼠下丘腦內(nèi)BDNF由mRNA向蛋白翻譯的過程。

本研究中幼齡期長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)大鼠血清BDNF沒有發(fā)生顯著變化。在中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后即刻血清BNDF可出現(xiàn)暫時(shí)的升高，在高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)后的研究也發(fā)現(xiàn)，血清中BDNF出現(xiàn)一段時(shí)間的升高。但運(yùn)動(dòng)后血清中BDNF升高保持的時(shí)間較短，在運(yùn)動(dòng)停止后會(huì)迅速返回到基礎(chǔ)水平，推測(cè)運(yùn)動(dòng)對(duì)安靜狀態(tài)下血清中BDNF含量影響較小。

綜上，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)使幼齡大鼠下丘腦BDNF和pro-BDNF蛋白表達(dá)水平同時(shí)升高。