張海芳，王 林，劉 潔，周文斌，張劉珍，善亞君，余祖胤，劉 萍，唐紅衛(wèi)，從玉文△

（1.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州221002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；3.北京武警總醫(yī)院，北京100390；4.解放軍總醫(yī)院海南分院藥劑科，海南三亞572013）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma）是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、致死率高［1］。目前，早期肝癌的主要治療手段仍是手術(shù)切除和肝臟移植。但由于肝癌起病隱匿、缺乏早期癥狀體征，超過70%的患者在確診時(shí)已失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，只能采取非手術(shù)的保守療法［2］。全身化療是保守療法的重要手段之一，但現(xiàn)有的化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性不強(qiáng)、引起的毒副反應(yīng)較大且易發(fā)生腫瘤耐藥。因此，尋找治療肝癌的新藥是目前亟待解決的問題。

珊瑚樹（viburnum odoratissimum）是忍冬科（caprifoliaceae）莢艸迷屬植物，始載于《中國(guó)高等植物圖鑒》，它的枝葉可入藥，有通經(jīng)活絡(luò)功效，主治風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛、骨折。珊瑚樹中主要含有二萜、三萜、黃酮、倍半萜、木脂素及香豆素苷等類化合物［3］。其中vibsanin型二萜類化合物是珊瑚樹的特征化合物［4］。該類化合物分為3種亞型結(jié)構(gòu)即十一元環(huán)型、七元環(huán)型和重排型，主要具有細(xì)胞毒、抗菌、魚毒、抑制植物生長(zhǎng)等活性，其中細(xì)胞毒活性報(bào)道較多。然而，有關(guān)此類化合物的抗腫瘤活性報(bào)道十分零散不系統(tǒng)，且缺乏相關(guān)作用機(jī)制的深入研究［5-10］。本實(shí)驗(yàn)室從云南珊瑚樹（viburnum odoratissimum Ker-Gal.var.sessiliflorum）的葉子中分離提取得到多種十一元環(huán)二萜類化合物，研究其中的1＃、2＃3、8＃、10＃、12＃5種二萜化合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

珊瑚樹化合物，化合物儲(chǔ)存液用DMSO配制，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋；RPMI-1640培養(yǎng)液，美國(guó) Gibico公司；胎牛血，中國(guó)杭州四季青公司；RNA酶，美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán) ，Thermo公司；臺(tái)盼藍(lán)，美國(guó) Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，北京寶賽生物技術(shù)有限公司；Apo-ONE Homogeneous Caspase-3／7試劑盒，美國(guó)Promega公司

1.2 儀器

FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton Dickinson；DNM-9602G型酶標(biāo)儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司；便攜式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

人白血病 K562、人肝癌 HepG2和人食道癌EC109細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室凍存；K562、HepG2和EC109細(xì)胞株以 2×105cells／ml的密度種植在 50 mm2的培養(yǎng)瓶中，用含體積分?jǐn)?shù)10%牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

測(cè)5種化合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響：空白對(duì)照組：加入100μl DMSO；對(duì)照組：HepG2細(xì)胞＋含血清的RPMI1640培養(yǎng)液，共100μl；實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)10個(gè)濃度組。HepG2細(xì)胞＋化合物1＃、2＃3、8＃、10＃、12＃（使其終濃度分別為 0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100μmol／l）共 100μl。

測(cè)化合物1＃對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響：空白對(duì)照組：加入 100μl DMSO；對(duì)照組：HepG2、EC109、K562細(xì)胞＋含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，共100μl；實(shí)驗(yàn)組：共設(shè) 10個(gè)濃度組。HepG2、EC109、K562細(xì)胞＋化合物1＃（使其終濃度分別為 0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100μmol／L）共 100 μl。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以 1.0×105cells／ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，將96孔培養(yǎng)板放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液，取二萜類化合物儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)組加入二萜類化合物，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每孔加入20μl MTT溶液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 4 h后，微量槍汲取上清棄去后，每孔加200μl DMSO溶液，在振蕩器輕輕振蕩15min，沉淀物溶解，MTT法檢測(cè)珊瑚樹化學(xué)成分對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖影響，酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)570 nm處讀取吸光值，繪制劑量效應(yīng)曲線，求出珊瑚化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.5 細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法

對(duì)照組：HepG2細(xì)胞（密度為 0.5×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，共2 ml；實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)5個(gè)濃度組。HepG2細(xì)胞（密度為0.5×105cells／ml）＋ 化合物 1＃（終濃度分別為 2.5、5、7.5、10 μmol／L），共 2 ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌 HepG2細(xì)胞，種于6孔培養(yǎng)板，2 ml每孔細(xì)胞懸液，將6孔培養(yǎng)板在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，換培養(yǎng)液，取化合物1＃儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)組加入化合物1＃，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度。在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，24 h，36 h，48 h，用胰蛋白酶消化離心收集所有的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)，并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

空白對(duì)照組；2 ml DMSO溶液；對(duì)照組：HepG2細(xì)胞（密度為1×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，共2 ml；實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)5個(gè)濃度組。HepG2細(xì)胞（密度為1×105cells／ml）＋不同濃度的化合物1＃（終濃度分別為 2.5、5、7.5、10μmol／l），共 2 ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞，種于6孔培養(yǎng)板，2ml每孔細(xì)胞懸液。將6孔培養(yǎng)板在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換培養(yǎng)液，取化合物1＃儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)組加入化合物1＃，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度。在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，24 h，，離心收集單細(xì)胞懸液（500×g，5 min），體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇固定4℃過夜，固定后的細(xì)胞離心，棄上清，100 μl（1 mg／ml）RNase A酶，37℃處理 30 min，PI（100 μg／ml）染色后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.7 AnnexinⅤ／PI雙標(biāo)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

空白對(duì)照組；2 ml DMSO溶液；對(duì)照組：HepG2細(xì)胞（密度為1×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，共2 ml；實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)5個(gè)濃度組。HepG2細(xì)胞（密度為1×105cells／ml）＋不同濃度的化合物1＃（終濃度分別為 5、7.5、10μmol／l），共 2ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105cells／ml的細(xì)胞密度接種于 6孔板在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，換培養(yǎng)液，取化合物1＃儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)組加入化合物1＃，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度。在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集單細(xì)胞懸液（500×g，5min），用PBS洗滌1次，每個(gè)樣品中加入100μl膜連蛋白Ⅴ（Annexin-Ⅴ），室溫孵育 15min，然后加入 400μl PI（50 μg／ml）流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 caspase-3／7活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組：Caspase 3／7試劑＋細(xì)胞培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組 ：Caspase-3／7試劑＋不經(jīng)處理的 HepG2細(xì)胞（密度為 1×105cells／ml）；實(shí)驗(yàn)組：Caspase 3／7試劑＋化合物＃處理的細(xì)胞。caspase 3／7活性檢測(cè)按Apo-ONE Homogeneous Caspase-3／7試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞經(jīng)化合物1＃處理后24 h，加入50μl含 Z-DEVD-羅丹明110的 Caspase-3／7緩沖液（Promega）培養(yǎng)板置室溫避光反應(yīng)30 min，用微孔板熒光檢測(cè)儀測(cè)定在激發(fā)光波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)535 nm處的熒光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素多水平方差分析。

2 結(jié)果

2.1 化合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

為了測(cè)定vibsane型二萜類化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響，HepG2細(xì)胞經(jīng)各化合物處理48 h，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示HepG2，細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，其中化合物1＃對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用最顯著，IC50值為 5.86±1.85μmol／l；化合物2＃3和 8＃活性次之，IC50值分別 7.34±2.07 μmol／L、7.54±0.99μmol／L，化合物 10＃和 12＃抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用則相對(duì)較弱，其IC50值分別為 18.15±2.49μmol／L和 15.94±3.63μmol／L。這五種化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。為了發(fā)現(xiàn)此類二萜化合物的結(jié)構(gòu)活性基團(tuán)，我們以其IC50值為指針，進(jìn)行初步的構(gòu)效關(guān)系分析。結(jié)果顯示，化合物C-14位（10?；衔铮┖?C-15位（12?；衔铮┓謩e連接-OH，活性顯著降低，而 C-15位連接-OOH（8＃化合物）對(duì)活性影響較弱。此外，在C-6、C-7位形成環(huán)氧基（2＃3化合物）也減弱化合物活性。結(jié)果提示該類化合物十一元環(huán)C11位連接側(cè)鏈的基團(tuán)修飾對(duì)化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性影響較大。

Fig.1 The antiproliferative effect of the chemical composition on HepG2 cells

2.2 1?；衔飳?duì)不同腫瘤系細(xì)胞增殖的影響

為了進(jìn)一步觀察不同組織來源的腫瘤細(xì)胞對(duì)化合物1＃的敏感性，將化合物1＃分別處理人肝癌HepG2、人白血病K562和人食道癌 EC109細(xì)胞，結(jié)果表明，化合物1＃對(duì)上述三種腫瘤細(xì)胞系的增殖均有不同程度的抑制作用，其 IC50分別為5.86±1.85μmol／L、8.68±1.29μmol／L、26.94±0.31μmol／L，其中 HepG2細(xì)胞對(duì)化合物1＃最為敏感（P＜0.01）。

鑒于上述MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇化合物1＃作為后續(xù)的研究對(duì)象。

2.3 1?；衔镆种艸epG2細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)

如表1所示，隨著化合物＃作用濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，較高濃度（7.5μmol／L、10μmol／L）化合物處理后的 HepG2細(xì)胞48 h內(nèi)幾乎沒有增殖，化合物1＃抑制HepG2細(xì)胞增殖具有顯著的時(shí)間（P＜0.05）和劑量依賴性（P＜0.01）。

Tab.1 Compound 1＃inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose and time dependentmanner（%，ˉx±s，n＝3）

2.4 1?；衔飳?duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，不同濃度（2.5～7.5μmol／L）的化合物 1＃作用于 HepG2細(xì)胞12 h后，化合物1＃引起HepG2細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞比例劑量依賴性增加，S期細(xì)胞比例劑量依賴性減少。2.5μmol／L化合物 1＃作用 HepG2細(xì)胞 12 h對(duì)細(xì)胞周期無影響，5、7.5μmol／L 1?；衔镒饔肏epG2細(xì)胞12 h，G0／G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.05），G2／M期細(xì)胞比例則改變不明顯。2.5～7.5μmol／L化合物1＃作用HepG2細(xì)胞24 h，G0／G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.05），G2／M期細(xì)胞比例則改變不明顯。這些結(jié)果顯示化合物1＃誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生顯著的G0／G1期周期阻滯（表 2）。

Tab.2 Effect of the compound 1＃on HepG2 cells cycle（%，ˉx±s，n＝3）

2.5 1?；衔镎T導(dǎo) HepG2細(xì)胞凋亡

用AnnexinⅤ／PI雙標(biāo)方法分析1?；衔飳?duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示1?；衔铮?～10 μmol／L）孵育細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率隨著1?；衔锏臐舛仍龈叨黾?，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。表明 1?；衔锟娠@著誘導(dǎo) HepG2腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖2，表3）。

Fig.2 The compound 1＃induced HepG2 cells apoptosis

Tab.3 The compound 1＃induced HepG2 cells apoptosis（%，ˉx±s，n＝3）

2.6 1?；衔飳?duì)HepG2細(xì)胞Caspase-3酶活性的影響

Apo-ONE HomogeneousCaspase-3／7試劑盒檢測(cè)caspase3／7活性變化結(jié)果顯示：化合物 1＃處理HepG2細(xì)胞24 h，隨著化合物濃度的增高，Caspase-3酶活性逐漸增強(qiáng)，較高濃度（5～10μmpl／L）化合物誘導(dǎo)Caspase-3／7活性明顯升高（與對(duì)照相比，P＜0.05，P＜0.01，表 4）。結(jié)果表明 1?；衔镎T導(dǎo)劑量依賴性Caspase-3／7激活。

Tab.4 Activity assay Caspase 3 activation（%，ˉx±s，n＝3）

3 討論

目前，對(duì)于不能手術(shù)治療的晚期肝癌，其中全身化療是其治療的重要手段之一。但是大多數(shù)化療藥都因選擇性差，毒副作用大而且容易產(chǎn)生耐藥性，因此，尋找高效、低毒、選擇性強(qiáng)的天然抗腫瘤藥物很有必要。本研究首次報(bào)道珊瑚樹特有的vibsane型二萜類化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明化合物1＃抑制腫瘤作用最強(qiáng)，且對(duì)HepG2細(xì)胞最為敏感，因此選擇化合物1＃為后續(xù)的研究對(duì)象；化合物1＃能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0／G1期阻滯和細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)vibsane型二萜類化合物均有抗腫瘤活性，抑制構(gòu)效關(guān)系分析表明十一元環(huán)C11位連接側(cè)鏈的基團(tuán)修飾對(duì)化合物活性有明顯影響。由于篩選的化合物有限，我們對(duì)此類化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵基團(tuán)依然知之甚少，尚需進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾后評(píng)價(jià)其構(gòu)效關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，體內(nèi)各種細(xì)胞自主有序性的死亡。細(xì)胞凋亡調(diào)控失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡抵抗（resistance to apoptosis）是腫瘤發(fā)生的主要原因之一［11，12］。而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的主要機(jī)制之一，多數(shù)抗腫瘤藥物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［13］。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為尋找抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)。本文研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的1?；衔镲@著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期 G0／G1期阻滯，隨著藥物濃度提高，則細(xì)胞凋亡明顯增加，表現(xiàn)為磷脂酰絲氨酸外翻以及Caspase3／7激活。Caspase可分為兩類：始動(dòng)Caspases和效應(yīng)Caspases，前者包括 caspase-2，-8，-9及-10，后者包括 caspase-3，-6及-7［14］。與 Caspase相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)路徑主要有兩個(gè)：一是細(xì)胞表面死亡受體途徑，另一個(gè)是線粒體途徑［15］。本研究發(fā)現(xiàn)1?；衔镲@著激活 Caspase3／7，提示其可能激活Caspase通路參與其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但化合物激活何種caspase凋亡途徑仍未可知，其是否誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡也有待進(jìn)一步研究。我們?cè)谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，正深入研究vibsane型二萜類化合物如何影響細(xì)胞周期和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，及其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶活性和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。

珊瑚樹中的vibsanin型二萜類化合物在自然界植物中分布非常有限，但其結(jié)構(gòu)又是復(fù)雜多樣的，且活性特點(diǎn)各異、強(qiáng)弱不一，因此對(duì)vibsanin型二萜類化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化、活性篩選及構(gòu)效關(guān)系分析，并對(duì)其可能的抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行深入研究，有望為研發(fā)新型天然植物類抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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