馬志勇，趙永才

（唐山師范學(xué)院體育系，河北唐山063000）

高血壓是危害人類健康的疾病之一，易引發(fā)心腦血管疾病，目前仍以藥物治療為主，近年來(lái)非藥物治療受到重視。運(yùn)動(dòng)療法具有良好治療效果，而且國(guó)內(nèi)外較多研究證實(shí)規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可降低高血壓患者血壓，減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低對(duì)藥物的依賴，改善患者的生活質(zhì)量［1，2］。但運(yùn)動(dòng)降低血壓的分子機(jī)制相對(duì)來(lái)說(shuō)研究較少，運(yùn)動(dòng)療法降低血壓通過哪些途徑，相關(guān)機(jī)制還不清楚。

高血壓與血管的生長(zhǎng)和通暢有關(guān)，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（endothelialgrowth factor，VEGF）與血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)，是高血壓疾病研究的熱點(diǎn)。VEGF能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，具有增加微靜脈、小靜脈通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖以及誘導(dǎo)血管形成等作用［3］。肌肉大量毛細(xì)血管生成受多種因素影響，常規(guī)體力活動(dòng)可以保持和維持機(jī)體骨骼肌毛細(xì)血管的水平，運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)毛細(xì)血管密度的提高，這一過程與血管剪切力增加、肌纖維牽拉、能量代謝增加及肌肉氧分壓改變有關(guān)系，這些研究在鍛煉群體上已得到驗(yàn)證［4］。另外骨骼肌是血液重要儲(chǔ)存器官，其毛細(xì)管數(shù)量多少和通暢性將會(huì)直接影響到血壓的高低，因此骨骼肌中VEGF及其受體（endothelial growth factor receptor，VEGFR）等血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子會(huì)影響到骨骼肌毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響血壓。研究［5］發(fā)現(xiàn)在骨骼肌靜置萎縮模型中，骨骼肌毛細(xì)血管密度下降，而通過血管緊張素的治療發(fā)現(xiàn)骨骼肌毛細(xì)血管密度得以維持，同時(shí)VEGF及VEGFR的含量和毛細(xì)血管密度保持正向關(guān)聯(lián)。因此有必要研究運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌VEGF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial NO synthase，eNOS）等血管調(diào)節(jié)因子的影響，這對(duì)了解運(yùn)動(dòng)治療高血壓的內(nèi)在機(jī)制具有重要意義。本研究考察游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓大鼠血壓、骨骼肌VEGF、VEGFR、eNOS等因子的影響，分析血壓變化與肌肉血管調(diào)節(jié)因子的聯(lián)系，探索運(yùn)動(dòng)降壓分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

3個(gè)月齡雄性原發(fā)性高血壓（spontaneous hypertensive rat，SHR）大鼠14只（北京維通利華有限公司提供，SPF級(jí)，280 g左右），隨機(jī)分為2組（n＝7）：高血壓對(duì)照組（SHR-C），高血壓運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（SHR-T）；同樣月齡正常血壓（WKY）大鼠7只作為正常血壓對(duì)照組（WKY-C），分籠飼養(yǎng)，室溫 20℃～25℃，濕度40%～60%，自然光照，自由飲食，定期消毒滅菌。

1.2 運(yùn)動(dòng)方式

SHR-T大鼠在自制泳池中先進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練，然后進(jìn)行10周無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5 d，每天運(yùn)動(dòng)1次，第1周每次運(yùn)動(dòng)40 min，第2周50 min，第3周增加到60 min后保持不變，直至訓(xùn)練完畢，WKY-C、SHR-C組不運(yùn)動(dòng)。SHR-T訓(xùn)練結(jié)束24 h后三組大鼠引頸處死，提取比目魚肌，液氮速凍后冷凍保存，進(jìn)行后續(xù)PCR和免疫印跡等測(cè)定。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 血壓和脈搏檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)大鼠清醒狀態(tài)下，使用無(wú)創(chuàng)傷鼠尾加壓阻斷法測(cè)量大鼠安靜收縮壓（systolic blood pressure，SBP），以鼠尾光電容積脈搏波隨尾套壓力下降而重新出現(xiàn)作為收縮壓的檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)嚴(yán)格按照RBP-1型大鼠血壓計(jì)說(shuō)明書進(jìn)行。運(yùn)動(dòng)方案開始前一周大鼠熟悉血壓檢測(cè)環(huán)境和儀器，訓(xùn)練開始前及結(jié)束后下午5點(diǎn)所有大鼠測(cè)壓1次，同時(shí)記錄心率（heart rate，HR）。

1.3.2 免疫印跡法分析 VEGF、VEGFR2和 eNOS的表達(dá) 使用提取的冷凍肌組織提取總蛋白，稱取適量肌組織后加入含有PMSF的RIPA裂解液（碧云天生物科技研究所提供），用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，然后低溫14 000×g離心5 min。按常規(guī)操作提取蛋白并上樣，其常規(guī)程序?yàn)椋?%～15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白；將帶有目的條帶的凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，一抗：VEGF（1∶500）、VEGFR2（1∶500）、eNOS（1∶1 000），VEGF、VEGFR2一抗（北京博奧森生物公司），eNOS一抗（CST公司）；4℃過夜孵育后洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST再洗膜，最后化學(xué)發(fā)光液孵育印跡膜，凝膠成像系統(tǒng)半定量分析測(cè)得的灰度值，GAPDH表達(dá)量作為參照進(jìn)行結(jié)果校正。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè) VEGFmRNA的含量 取 100 mg肌組織加入 1 ml Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒要求操作，通過檢測(cè)RNA樣品 A260／A280的比值，確定 RNA的純度。VEGF引物序列，上游：5-GGCTCACTTCCAGAAACACG-3，下游：5-GTGCTCTTGCAGAATCTAGTGG-3，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green染料法，PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括 2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，12.5μl SYBR Green Master Mix，2μl目的基因引物和 8.5μl滅菌三蒸水，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算 mRNA相對(duì)表達(dá)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后各組大鼠血壓、心率的變化

訓(xùn)練前各組血壓有差異，具體為SHR-C、SHR-T大鼠血壓高于WKY-C大鼠血壓，具有非常顯著性差異（P＜0.01）；而 SHR-C、SHR-T兩組由原發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分組，血壓無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)SHR-T組血壓產(chǎn)生影響，SHR-T組血壓無(wú)論是與運(yùn)動(dòng)前自身還是與運(yùn)動(dòng)后SHR-C組比較，血壓均顯著性降低（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前各組心率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），訓(xùn)練后 SHR-T組心率與運(yùn)動(dòng)前自身、運(yùn)動(dòng)后SHR-C、WKY-C比較均顯著性降低（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Changes of blood pressure and heart rate before and after training（ˉx±s，n＝7）

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后各組大鼠VEGF mRNA的表達(dá)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果以WKY-C為對(duì)照組，以WKY-C相對(duì)值為1，對(duì)比各組大鼠實(shí)驗(yàn)后骨骼肌VEGFmRNA表達(dá)的差異，WKY-C和SHR-C兩組大鼠VEGFmRNA（1.00±0.20，0.92±0.11）無(wú)顯著性差異，本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠VEGFmRNA的異常，其表達(dá)只有低于WKY-C組的趨勢(shì)，但SHR-T組的VEGFmRNA表達(dá)（1.23±0.16）顯著性高于 WKY-C、SHR-C組（P＜0.05，圖 1）。

Fig.1 VEGFmRNA expression in different groups after exercise training VEGF：Vascular endothelial growth factor；WKY-C：NormotensiveWistar-kyoto control；SHR-C：Spontanoushypertensive rats control；SHR-T：Spontanous hypertensive rats training*P＜0.05 vs WKY-C；＃P＜0.05 vs SHR-C

2.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后各組大鼠 VEGF、VEGFR2、eNOS蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫印跡測(cè)定發(fā)現(xiàn)各組 VEGF、VEGFR2、eNOS蛋白表達(dá)不同，SHR-C組VEGF顯著性低于WKY-C組（P＜0.05），表明原發(fā)性高血壓大鼠肌肉VEGF先天低于正常血壓大鼠，而SHR-T組經(jīng)過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后VEGF表達(dá)雖然還低于WKY-C組，但卻顯著性高于SHR-C組（P＜0.05），表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠提高 VEGF表達(dá)；WKY-C組和SHR-C組VEGFR2表達(dá)無(wú)顯著差異，但經(jīng)過訓(xùn)練后SHR-T組VEGFR2表達(dá)顯著高于前兩組（P＜0.05）；SHR-C組 eNOS表達(dá)顯著性低于WKY-C（P＜0.05），但 SHR-T組訓(xùn)練后 eNOS表達(dá)高于 SHR-C組，有非常顯著性差異（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Expressions of VEGF、VEGFR2 and eNOS in different groups（ˉx±s，n＝7）

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后不同組別大鼠血壓、心率的差異

原發(fā)性高血壓以藥物治療為主，但易產(chǎn)生依賴。體育運(yùn)動(dòng)，具有良好降壓效果。有氧運(yùn)動(dòng)降低患者血壓的研究較多，大多數(shù)研究采用有大量肌群參與的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)力性運(yùn)動(dòng)，如健走、慢跑、游泳以及中國(guó)傳統(tǒng)體育項(xiàng)目，發(fā)現(xiàn)具有良好效果［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練前SHR-C組和SHR-T組血壓顯著性高于WKYC組（P＜0.01），表明本研究高血壓大鼠模型符合研究要求。SHR-T組訓(xùn)練后血壓明顯低于SHR-C組和自身訓(xùn)練前水平（P＜0.05），表明本研究的游泳訓(xùn)練對(duì)高血壓大鼠產(chǎn)生良好效果，能有效降低大鼠血壓。本研究和以前高血壓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯拷Y(jié)果類似，張陵［8］研究發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練使SHR大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)素顯著性增加，且血壓降低，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加腎上腺髓質(zhì)素，進(jìn)而舒張血管，降低血壓。另一篇研究［9］也發(fā)現(xiàn)SHR大鼠大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能改善血漿前列環(huán)素／血栓烷平衡，降低血壓及血栓形成。由此可見，有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低原發(fā)性高血壓大鼠血壓。另外本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)組大鼠安靜心率無(wú)顯著性差異，SHR-T組訓(xùn)練后心率顯著性低于SHR-C組和訓(xùn)練前自身（P＜0.01），也顯著性低于WKY-C組（P＜0.01），表明有氧訓(xùn)練對(duì)心血管機(jī)能產(chǎn)生良好適應(yīng)，安靜心率降低和血壓下降同步發(fā)生，安靜心率降低可能與心肺耐力水平增加有關(guān)，心率下降是心血管系統(tǒng)適應(yīng)的結(jié)果。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后不同組別大鼠VEGF、VEGFR2及eNOS的差異

關(guān)于高血壓的形成認(rèn)為和外周器官骨骼肌有一定關(guān)系，認(rèn)為這類人群先天或后天缺乏體力活動(dòng)等因素易引起血管過度收縮，導(dǎo)致部分微動(dòng)脈阻塞，進(jìn)而引起毛細(xì)血管充盈不足，容易引發(fā)毛細(xì)管密度減少和微循環(huán)障礙等問題［10，11］。VEGF屬于生血管因子，VEGF通過與血管內(nèi)皮相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時(shí)可增加血管通透性使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管生成，是目前認(rèn)為最強(qiáng)烈的血管生成因子［3］。另外 eNOS廣泛分布于存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、腎小管上皮細(xì)胞等細(xì)胞中，通過催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，在心血管系統(tǒng)中，具有維持血管正常舒張功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、修復(fù)及抑制血小板聚集等功能［12］，降低eNOS基因表達(dá)，易出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷和血壓升高［13］。

目前認(rèn)為肌肉血管生長(zhǎng)與VEGF、VEGFR2及eNOS有密切關(guān)系，認(rèn)為eNOS能夠刺激VEGF產(chǎn)生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)并對(duì)抗凋亡［14］。還有研究發(fā)現(xiàn)在成年小鼠組織器官中敲除基因或抑制VEGF表達(dá)，能顯著性降低組織毛細(xì)血管密度并提高凋亡水平［15］。另外VEGF促進(jìn)血管生長(zhǎng)的途徑與VEGFR2關(guān)系最為密切，兩者結(jié)合能引起內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［16］，并且研究發(fā)現(xiàn)VEGF和VEGFR2結(jié)合主要通過PI3K信號(hào)途徑和其下游Akt信號(hào)分子傳導(dǎo)信號(hào)，進(jìn)一步刺激eNOS基因的表達(dá)，從而引起血管再生和抗凋亡作用［17］。

本研究沒有發(fā)現(xiàn)SHR-C組VEGFmRNA異常，其表達(dá)有低于 WKY-C組的趨勢(shì)，但 SHR-T組的VEGFmRNA表達(dá)明顯高于WKY-C、SHR-C組，說(shuō)明基礎(chǔ)狀態(tài)下高血壓大鼠VEGFmRNA表達(dá)和正常大鼠水平相當(dāng)，而經(jīng)過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能顯著提升高血壓大鼠VEGFmRNA表達(dá)，這為加速VEGF蛋白合成奠定了基礎(chǔ)。而對(duì)于各組VEGF蛋白的測(cè)定卻發(fā)現(xiàn)和VEGFmRNA并不完全一致，首先SHR-C組VEGF顯著性低于WKY-C組，表明雖然VEGFmRNA表達(dá)兩組無(wú)顯著差異，但高血壓大鼠VEGF蛋白卻明顯偏低，表明高血壓大鼠VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯水平受到限制，VEGF蛋白過低限制了血管的生長(zhǎng)，這也可能是原發(fā)性高血壓大鼠高血壓形成的一個(gè)原因。另外運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后SHR-T組VEGF蛋白顯著提升，表明運(yùn)動(dòng)能有效促進(jìn)VEGF的合成，這也是降壓的機(jī)制之一。本研究和前人的研究結(jié)果相似，宋海霞［18］等人發(fā)現(xiàn)跑臺(tái)訓(xùn)練同樣促進(jìn)了大鼠股四頭肌VEGF蛋白顯著提高，認(rèn)為VEGF表達(dá)提高對(duì)促進(jìn)血管生長(zhǎng)、減少肌肉缺血有積極作用。結(jié)合本研究可發(fā)現(xiàn)無(wú)論高血壓疾病模型還是健康個(gè)體，有氧耐力運(yùn)動(dòng)均可提高 VEGF的表達(dá)。SHR-T組訓(xùn)練后VEGFR2、eNOS相比SHR-C組同步升高，而且還明顯高于WKY-C組，這表明VEGFR2和eNOS對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練更敏感。

國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)適量運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)大鼠心肌VEGF的表達(dá)，毛細(xì)血管面積比增加，但大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌有損害，抑制VEGF的表達(dá)［19］。而國(guó)外研究也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉可上調(diào)老年大鼠心肌和骨骼肌VEGFmRNA和蛋白水平，增加毛細(xì)血管密度，對(duì)抗因衰老而造成心血管調(diào)節(jié)信號(hào)途徑的減弱［20，21］。結(jié)合本研究，可認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)肌肉血管生成因子表達(dá)，有利于血管生成。毛細(xì)血管密度提高能改善外周血循環(huán)效率，可能是運(yùn)動(dòng)降壓的原因之一。本研究沒有檢測(cè)毛細(xì)血管密度，是不足之處，運(yùn)動(dòng)降壓機(jī)制還需繼續(xù)研究。

綜上所述，原發(fā)性高血壓大鼠血壓高于對(duì)照組，骨骼肌VEGF、eNOS蛋白低于對(duì)照組；有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能明顯降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓，促進(jìn)骨骼肌VEGFmRNA、VEGFR2、eNOS等蛋白表達(dá)，血管生長(zhǎng)因子水平增加有利于血管生成，可能是運(yùn)動(dòng)降壓的一個(gè)機(jī)制。

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