蔣紅艷,姚安貴,江尚飛

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)院,重慶 400030)

青蒿琥酯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

蔣紅艷,姚安貴△,江尚飛

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院,重慶 400030)

近年來的研究表明，青蒿琥酯具有抗腫瘤活性，能夠明顯抑制胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制包括啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，增高Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)等。本文對(duì)青蒿琥酯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

青蒿琥酯；腫瘤細(xì)胞；凋亡

青蒿琥酯(artesunate,Art)屬于青蒿素衍生物,由于青蒿素及其衍生物起效快、毒性低、療效確切,已成為臨床上治療瘧疾的一線藥物［1-2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯還有抗腫瘤活性,具有成為一種新的高效低毒抗腫瘤藥物的潛力,其對(duì)多種腫瘤,如胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤等起抑制作用,本文對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行大量研究,以期進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn),為青蒿琥酯的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)［3］。

1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

1.1 誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡 吳方紅等［4］體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞HGC27細(xì)胞,青蒿琥酯組加入青蒿琥酯終濃度為10、20、40、80、100mg/L的培養(yǎng)液,對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液,并設(shè)立調(diào)零孔,四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測(cè)定其對(duì)HGC27細(xì)胞增殖的影響;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;青蒿琥酯(濃度分別為20、40、80mg/L)處理HGC27細(xì)胞48 h后,分別采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、分光光度計(jì)檢測(cè)casepase-3、caspase-9相對(duì)活性、Western blot法檢RUNX-3蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濃度為10～100mg/L的青蒿琥酯能呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制HGC27細(xì)胞的增殖;倒置顯微鏡下可觀察到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。濃度分別為20、40、80 mg/L的青蒿琥酯作用于HGC27細(xì)胞48h后,細(xì)胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%,而對(duì)照組凋亡率僅為2.2%。青蒿琥酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與其增加細(xì)胞 casepase-3、caspase-9活性以及上調(diào)RUNX-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。此外,青蒿琥酯也能抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,其中caspase-3蛋白的高表達(dá)在促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡中起著重要作用［5］。

1.2 誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞凋亡 劉亮等［6］以濃度分別為30、60、120μmol/L的青蒿琥酯作用于食管鱗癌Ec9706細(xì)胞12 h,對(duì)照組采用生理鹽水替代青蒿琥酯。于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,熒光染料羅丹明123染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯作用于Ec9706細(xì)胞后,Ec9706細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞變圓,體積變小,并漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。不同濃度的青蒿琥酯作用于Ec9706細(xì)胞12 h后,藥物呈劑量依賴性地促進(jìn)Ec9706細(xì)胞的凋亡,與對(duì)照組相比具有極顯著性差異(P＜0.01);藥物呈劑量依賴性地降低Ec9706細(xì)胞線粒體膜電位,與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。與對(duì)照組相比,青蒿琥酯組Ec9706細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01),且呈藥物劑量依賴性。因此,降低細(xì)胞線粒體膜電位,啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑,激活caspase-3蛋白等可能是青蒿琥酯誘導(dǎo)Ec9706細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1.3 誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡 黃偉煒等［7］采用濃度分別為10,20,30μmol/L青蒿琥酯處理人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率分別為(17.1±3.8)%,(29.5±5.1)%,(41.4±5.8)%,顯著高于空白對(duì)照組的(5.1±1.4)%(P＜0.05);采用濃度為20μmol/L青蒿琥酯處理人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8細(xì)胞后,細(xì)胞G0/G1期所占比例隨著藥物作用時(shí)間延長而增加,S期與G2/M期細(xì)胞所占比例則下降;采用濃度分別為10,20,30μmol/L青蒿琥酯處理組Bax蛋白表達(dá)水平分別為(0.20±0.03),(0.40±0.05)和(0.50±0.08),顯著高于空白對(duì)照組的(0.06±0.02)(P＜0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)水平未見明顯變化,Bcl-2/Bax呈下降趨勢(shì)。因此,青蒿琥酯誘導(dǎo)凋亡人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8細(xì)胞的作用機(jī)制可能與其阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞周期、上調(diào)促癌基因Bax表達(dá)有關(guān)。

1.4 誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞凋亡 朱奔奔等［8］研究了青蒿琥酯對(duì)人胃腺癌MKN45細(xì)胞株增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用,將不同濃度的青蒿琥酯作用于體外培養(yǎng)的人胃腺癌MKN45細(xì)胞株,空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基,采用MTT檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)不同濃度的青蒿琥酯處理MKN45細(xì)胞株后凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-9及caspase-3等表達(dá)情況。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青蒿琥酯對(duì)MKN45細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,且對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用與藥物作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)(P＜0.05)。并隨著青蒿琥酯濃度的增加,MKN45細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P＜0.05)。ART使MKN45細(xì)胞 Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低,Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表達(dá)明顯增高,且對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用與藥物濃度呈正相關(guān)。

1.5 誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡 雷佳紅等［9］采用青蒿琥酯(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)處理人肝癌 HepG2 細(xì)胞 48 h,藥物呈濃度依賴性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡,且當(dāng)青蒿琥酯濃度在6.25μg/mL以上時(shí),各組凋亡率與對(duì)照組比較有極顯著性差異(P＜0.01),細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變。各組caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組比較極顯著性差異(P＜0.01)。因此認(rèn)為青蒿琥酯能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與增強(qiáng)凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

1.6 誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡 黃利華［10］提取11例急性白血病患者骨髓液進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),以對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞為干預(yù)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組將不同濃度青蒿琥酯作用于細(xì)胞,對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液,分別采用MTT法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)人AL原代細(xì)胞增殖的影響;透射電子顯微鏡觀察青蒿琥酯作用后細(xì)胞的形態(tài)變化;免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。其研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,各劑量組青蒿琥酯作用于人白血病原代細(xì)胞48 h后細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)2種不同的形式:脹亡,細(xì)胞體積明顯增大,細(xì)胞漿呈空泡樣改變,細(xì)胞膜部分完整,線粒體腫脹,細(xì)胞核多被擠向細(xì)胞一側(cè);凋亡,細(xì)胞體積縮小,染色質(zhì)固縮,或裂解形成1個(gè)或數(shù)個(gè)大小不一的致密凋亡小體。青蒿琥酯處理細(xì)胞48 h,可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2含量,促進(jìn)凋亡蛋白Bax、C-myc的釋放。推測(cè)其抗白血病作用的分子機(jī)制可能是線粒體途徑,但其最佳作用靶點(diǎn)有待研究。

1.7 誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡 王利娟等［11］探討了青蒿琥酯抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制,MTT實(shí)驗(yàn)顯示青蒿琥酯能夠呈劑量-時(shí)間依賴性地抑制HEC-1B細(xì)胞生長;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示青蒿琥酯能夠使G0/G1期細(xì)胞比例上升(P＜0.05),G2/M期細(xì)胞比例下降(P＜0.05);檢測(cè)凋亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,5mg/L青蒿琥酯組凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,20、80 mg/L青蒿琥酯組凋亡率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);RT-PCR結(jié)果顯示,青蒿琥酯組Livin mRNA表達(dá)下調(diào),caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)。因此,青蒿琥酯抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,其作用機(jī)制可能是通過抑制Livin mRNA表達(dá)、進(jìn)而增加caspase-3 mRNA表達(dá),誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

1.8 誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡 王素云等［12］研究表明,濃度為25～50μg/mL的青蒿琥酯對(duì)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的抑制率為33.55%～74.71%。濃度為50μg/mL青蒿琥酯誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞最大凋亡率達(dá)(68.1±5.9)%。采用不同濃度青蒿琥酯處理骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞48 h后,Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低,caspase-3、caspase-7 mRNA及蛋白活性明顯升高(P＜0.01)。因此,青蒿琥酯增強(qiáng)caspase-3、caspase-7活性,抑制抗凋亡分子survivin表達(dá)可能是其抑制骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞、誘導(dǎo)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1.9 誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡 肖敏等［13］觀察了青蒿琥酯對(duì)人皮膚惡性黑素瘤A875細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的青蒿琥酯能有效抑制A875細(xì)胞的增殖,并呈濃度依賴性;Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)A875細(xì)胞凋亡,并呈濃度依賴性。Western blot結(jié)果顯示不同濃度青蒿琥酯作用A875細(xì)胞后,caspase-3、caspase-8及caspase-9的蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)增高,并呈劑量依賴性,提示青蒿琥酯誘導(dǎo)A875細(xì)胞凋亡與上調(diào)caspase-8、caspase-9以及caspase-3有關(guān)。

1.10 誘導(dǎo)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株凋亡 陳均法等［14］采用MTT比色法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞體外生長的抑制作用;采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、DNA瓊脂糖凝膠電泳、DNA的PI染色等觀察和檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的凋亡;采用Western blot法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡過程中Bc-2、Bax、caspase-8和ICAD蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,以濃度為2～64μg/mL青蒿琥酯作用T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞,能夠抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)Jurkat細(xì)胞凋亡;隨著藥物濃度的增加,Bcl-2和ICAD蛋白表達(dá)逐漸下降,而Bax蛋白表達(dá)上調(diào),caspase-8蛋白出現(xiàn)明顯的剪切激活帶;提示青蒿琥酯既可通過線粒體途徑又可通過外源性途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡,但還需進(jìn)一步研究具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2 作用機(jī)制

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂具有非常密切的關(guān)系,細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用?；蛩缴洗偌?xì)胞凋亡基因如p53等的失活,以及抗細(xì)胞凋亡基因如Bcl-2,Survivin等的過度表達(dá),是腫瘤發(fā)生的重要原因。在正常組織中Bcl-2幾乎不表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)增高,且與細(xì)胞的分化程度有關(guān)［15-16］。Caspase家族是腫瘤細(xì)胞凋亡起始和執(zhí)行過程中非常重要的一系列蛋白因子,是細(xì)胞凋亡的核心,caspase家族與Bcl-2家族互相影響。Bcl-2抗凋亡相關(guān)蛋白可通過抑制線粒體膜電位、抑制caspase的活化。caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者,caspase-8、caspase-9是其中的重要蛋白,且procaspase-8、procaspase-9等分別從不同角度參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［17］。青蒿琥酯能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長,并促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞線粒體膜電位,啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑,增高 Bax、caspase-9及 caspase-3蛋白表達(dá),降低Bcl-2蛋白表達(dá)等相關(guān)。但由于細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜,引起細(xì)胞凋亡的因素很多,且既往的研究多為體外實(shí)驗(yàn),因此,青蒿琥酯抗腫瘤的體內(nèi)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3 討論

青蒿琥酯作為青蒿素的水溶性衍生物,除了具有抗瘧作用外,還有許多新作用,而其抗腫瘤作用更是引起人們的廣泛關(guān)注,臨床應(yīng)用前途廣泛。隨著其抗腫瘤作用的不斷深入探索和臨床研究的開展,青蒿琥酯應(yīng)用于多種腫瘤的治療前景廣闊。

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(編校:譚玲)

Research progresses of artesunate in inducing tumor cell apoptosis

JIANG Hong-yan,YAO An-gui△,JIANG Shang-fei

(College of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 400030,China)

In recent years,studies have shown thatartesunate has anti-tumor activity,and could inhibit gastric cancer,esophageal cancer,colon cancer,liver cancer,melanoma,myeloma cell proliferation and induce apoptosis mechanisms including to start within endogenous mitochondrial apoptotic pathway,increase Bax,caspase-9 and caspase-3 protein expression,and reduce Bcl-2 protein expression and so on.In this paper,the effect and mechanism of artesunate inducing tumor cell apoptosis are reviewed.

artesunate;tumor cell;apoptosis

TN248.1

A

1005-1678（2014)06-0181-03

重慶市教委科研項(xiàng)目(KJ1402601)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2012-1-093)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2012-2-17)

蔣紅艷，女，研究生，副教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：jianghy200568@126.com；姚安貴，通信作者，男，本科，副教授，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)，E-mail：jianghy200568@sina.com。