王悅,李京,李穎穎,范慧紅

(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050)

依諾肝素鈉中殘留N，N-二甲基甲酰胺的測(cè)定

王悅,李京,李穎穎,范慧紅△

(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050)

目的 建立依諾肝素鈉原料中N，N-二甲基甲酰胺殘留的測(cè)定方法。方法 采用乙醇作為萃取劑，使依諾肝素鈉生成沉淀，N，N-二甲基甲酰胺則溶于乙醇，取上清液直接進(jìn)樣，用氣相色譜儀分析。色譜柱為Agilent DB-wax（30m×0.53mm，1.0μm)；載氣為高純氮?dú)?；流速?m L/min；采用程序升溫的方式；進(jìn)樣口溫度為200℃；FID檢測(cè)器溫度為250℃。結(jié)果 該方法測(cè)得的線(xiàn)性范圍為8.8～880μg/mL；定量限為11.6μg/mL；檢出限為3.5μg/m L；加樣回收率為94.8%，RSD為2.0%。結(jié)論 該檢測(cè)方法方便、快速、準(zhǔn)確，避免了樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，可用來(lái)控制依諾肝素鈉中痕量N，N-二甲基甲酰胺殘留。

N，N-二甲基甲酰胺；依諾肝素鈉；氣相色譜法

低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是酶解或化學(xué)裂解肝素后得到的產(chǎn)物,其抗血栓作用優(yōu)于肝素,生物利用度高、出血傾向小,是肝素的第二代產(chǎn)品［1］。根據(jù)原料來(lái)源、生產(chǎn)工藝［2］、末端結(jié)構(gòu)［3-5］的不同,低分子肝素被分為許多不同的種類(lèi),它們的分子量與分子量分布、硫酸化程度、抗凝活性均不相同［6］。不同種類(lèi)的低分子肝素在其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)使用到不同的有機(jī)溶劑;相同品種的LMWH也會(huì)由于不同工藝步驟而使用不同的溶劑,因此應(yīng)分別控制。

依諾肝素鈉是將肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿裂解而獲得的一種低分子肝素,生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜,在生產(chǎn)過(guò)程中除LWMH常用到的甲醇、乙醇等溶劑外,不同企業(yè)根據(jù)工藝不同,還會(huì)使用二氯甲烷［7］或N,N-二甲基甲酰胺等溶劑。N,N-二甲基甲酰胺屬于第二類(lèi)有機(jī)溶劑,需要對(duì)其在藥品中的殘留量進(jìn)行控制,ICH規(guī)定其殘留量不得超過(guò)0.088%。目前藥典項(xiàng)目有關(guān)均采用氣相色譜法來(lái)測(cè)定揮發(fā)性溶劑的殘留量,由于N,N-二甲基甲酰胺的沸點(diǎn)較高(149℃～156℃),不容易充分汽化［8］,中國(guó)藥典明確建議采用直接進(jìn)樣法測(cè)定此類(lèi)沸點(diǎn)較高的溶劑［9］。但依諾肝素鈉除溶于水外,不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑,因此本研究曾嘗試采用水溶液直接進(jìn)樣及頂空進(jìn)樣等方式,結(jié)果均不理想?？紤]到依諾肝素鈉不溶于乙醇,而N,N-二甲基甲酰胺可與乙醇互溶的性質(zhì),本文建立了乙醇萃取的樣品處理方式,對(duì)依諾肝素鈉原料中殘留N,N-二甲基甲酰胺進(jìn)行定量檢查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 HP 6890 plus氣相色譜儀,HP 7683自動(dòng)進(jìn)樣器,FID檢測(cè)器,SDG-300氮?dú)淇找惑w機(jī)。

乙醇購(gòu)自CNW公司,絕對(duì)純;N,N-二甲基甲酰胺購(gòu)自J&K公司。6批依諾肝素鈉原料藥分別由杭州九源基因有限公司和深圳天道醫(yī)藥有限公司提供。

1.2 溶液制備

1.2.1 對(duì)照品溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取N,N-二甲基甲酰胺適量,用乙醇稀釋制成880μg/mL的貯備液。精密移取1.0mL置10mL量瓶?jī)?nèi),加乙醇稀釋至刻度,混勻即得。

1.2.2 供試品溶液:稱(chēng)取供試品1.0 g,置10 m L量瓶?jī)?nèi),加2 mL水溶解后,緩慢加入乙醇,邊加邊振搖并稀釋至刻度,混勻。室溫下放置至沉淀生成完全后,取上清液放入離心機(jī)內(nèi)10000 r/min離心5 min,取上清液0.45μm濾膜過(guò)濾即得。

1.3 色譜條件 色譜柱:AgilentDB-WAX(30m×0.53mm,1.0μm);載氣為高純氮?dú)?升溫梯度:起始溫度100℃,維持2 min;以5℃/min的速率升至140℃;流速為3mL/min;分流比為10∶1;進(jìn)樣口溫度為200℃;FID檢測(cè)器溫度為250℃。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按照1.2.1方法,配制不含N,N-二甲基甲酰胺的陰性溶液,進(jìn)樣1μL,記錄色譜圖,在N,N-二甲基甲酰胺出峰位置附近無(wú)色譜峰干擾。對(duì)照品溶液色譜圖內(nèi),乙醇與N,N-二甲基甲酰胺色譜峰分離度能夠符合要求(見(jiàn)圖1)。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖Fig.1 The chromatography of standard solution

2.2 線(xiàn)性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限考察分別精密吸取對(duì)照品貯備液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL,置 10mL量瓶?jī)?nèi),加入乙醇稀釋至刻度并混勻,得到含N,N-二甲基甲酰胺分別為8.8、17.6、44、88、176、440、880 μg/mL的系列線(xiàn)性溶液。 分別吸取上述線(xiàn)性溶液1μL進(jìn)樣,記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得出N,N-二甲基甲酰的回歸方程為Y=0.3254X-0.0575,r=0.9999。取低濃度溶液逐級(jí)稀釋,以信噪比為3得出檢測(cè)限為3.5μg/mL;以信噪比為10時(shí)得出定量限為11.6μg/mL。

2.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液1μL,注入氣相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,測(cè)得的N,N-二甲基甲酰胺峰面積RSD為0.26%,說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4 加樣回收率 稱(chēng)取9份已測(cè)定含量的樣品0.5 g,精密稱(chēng)定,按低、中、高3個(gè)濃度分別加入對(duì)照品貯備液0.4、0.5、0.6mL,每個(gè)濃度平行3份,充分混勻,加入1mL水溶解,緩慢加入乙醇,邊加邊振搖并稀釋至刻度,混勻。室溫下放置至沉淀生成完全后,取上清液放入離心機(jī)內(nèi)10000 r/min離心5min,取上清液0.45μm濾膜過(guò)濾。分別進(jìn)樣1μL,記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Sample recovery test results

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 將6批供試品分別按照1.2.2方法配制。取對(duì)照品溶液(圖1)和供試品溶液(圖2)各1μL進(jìn)樣,記錄峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中N,N-二甲基甲酰胺殘留量,結(jié)果均未檢出,可見(jiàn)受試樣品工藝中未使用N,N-二甲基甲酰胺作溶劑,或樣品中殘留量低于檢出限。

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 The chromatography of sample solution

3 討論

3.1 樣品處理方式 依諾肝素鈉除溶于水外,幾乎不溶于任何有機(jī)溶劑,本研究曾采用純化水作為溶劑,將供試品溶液直接進(jìn)樣,但色譜圖中N,N-二甲基甲酰胺色譜峰對(duì)稱(chēng)性較差;本研究還曾采用純化水作為溶劑,頂空進(jìn)樣,結(jié)果顯示,N,N-二甲基甲酰色譜峰重現(xiàn)性較差,嚴(yán)重影響定量準(zhǔn)確度。因此本研究最終選用乙醇萃取樣品的方式,先用少量純水將樣品溶解,再加入乙醇使依諾肝素鈉形成白色沉淀,而N,N-二甲基甲酰胺與水和乙醇都可互溶,可直接進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定。該方法避免了樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾,配制樣品過(guò)程水的用量較少,得到的色譜峰對(duì)稱(chēng)性較好,結(jié)果重現(xiàn)性較高。可見(jiàn),與直接進(jìn)樣及頂空進(jìn)樣方式相比,乙醇萃取后直接進(jìn)樣的方式更有優(yōu)勢(shì)［10］。

3.2 色譜柱選擇 本研究曾嘗試選用中等極性的DB-624毛細(xì)管柱進(jìn)行分離分析,但結(jié)果表明溶劑峰與主峰分離度不佳,考慮到N,N-二甲基甲酰胺極性較大,故選用改性聚乙二醇作為固定相的極性毛細(xì)管色譜柱DB-wax進(jìn)行分析,分離度得到較大改善。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)討論 目前國(guó)內(nèi)外藥典中僅有歐洲藥典(EP)8.0的那屈肝素鈣［11］品種里規(guī)定了乙醇的檢查項(xiàng)目,美國(guó)藥典(USP)及EP其它種類(lèi) LMWH均未在正文中規(guī)定［11-13］。我國(guó)2006年頒布的依諾肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)YBH06762006中收載了甲醇、乙醇和二氯甲烷的檢查項(xiàng)目,然而不同廠家在生產(chǎn)過(guò)程中使用的溶劑不同,除通用的甲醇、乙醇外,還會(huì)使用二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺。本研究聯(lián)合生產(chǎn)實(shí)際,在依諾肝素鈉新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的草案中增加了N,N-二甲基甲酰胺的檢查項(xiàng)目,并在其和二氯甲烷的檢查項(xiàng)后面標(biāo)注了“如使用”,檢驗(yàn)時(shí)可根據(jù)企業(yè)實(shí)際使用的溶劑有針對(duì)性地進(jìn)行測(cè)定。

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［11］ EP8.0［S］.2014:2815-2817，2392-2394，1988-1989，2968，3430.

［12］ EP 8.1［S］.2014:3749-3750.

［13］ USP37 NF32［S］.2014:2792-2795.

(編校:吳茜)

Determ ination of residual N,N-dimethylformam ide(DM F)in enoxaparin sodium

WANG Yue,LI Jing,LIYing-ying,FAN Hui-hong△

(National Institute for Food and Drug Control,Beijing 100050,China)

Objective To establish amethod to quantify the residual DMF in enoxaparin sodium.Methods Enoxaparin sodium was precipitated by ethanol,meanwhile the DMFwas soluble,and was analyzed by direct injection.The Agilent DB-wax capillary column(30m×0.53mm,1.0μm)was adopted with high-purity nitrogen as the carrier gas,with a flow rate of3.0mL/min,the injector temperature was 200℃,FID detector temperature was 250℃,and the temperature-programmedmethod wasused.Results The linear range of DMFwas8.8～880μg/mL,the LOQwas11.6μg/mL,the LOD was 3.5μg/mL and the average recoveries(n=9)was94.8%.Conclusion The potential contamination from samplematrix could be avoided by using this sample preparation step.Thismethod is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability,which could be used for quality control of trace DMF in enoxaparin sodium.

N,N-dimethylformamide;enoxaparin sodium;gas chromatography

TQ460.72

A

1005-1678（2014)06-0168-03

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(2012104008-1-16)

王悅，女，助理研究員，研究方向：多糖類(lèi)藥物質(zhì)量控制；范慧紅，通信作者，女，研究員，研究方向：生化藥物的質(zhì)量控制，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。