張 帆，王大可，李愛(ài)欣，王淑敏*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.公安邊防廣州指揮學(xué)校，廣東 廣州 510440)

大馬勃抗炎鎮(zhèn)痛及體外抑菌作用的研究

張 帆1,2，王大可1，李愛(ài)欣1，王淑敏1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.公安邊防廣州指揮學(xué)校，廣東 廣州 510440)

探討大馬勃子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液不同提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛以及體外抑菌活性，為大馬勃的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大馬勃各部分提取物均能明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹度和對(duì)醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)，其中大馬勃發(fā)酵液抗炎鎮(zhèn)痛效果最佳，抑制率最高，分別為42.9%和43.69%；同時(shí)各種提取物均有不同程度的抑制作用，并且MIC最小值為3.15 mg·mL-1。結(jié)果表明大馬勃子實(shí)體及液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛及抑菌作用，本著合理利用資源，走工業(yè)化生產(chǎn)道路，可利用發(fā)酵代謝產(chǎn)物來(lái)代替大馬勃子實(shí)體的相關(guān)臨床作用。

大馬勃提取物；抗炎作用；鎮(zhèn)痛作用；體外抑菌活性

大馬勃為常用食藥用真菌,具有止血、清肺、解毒、消腫、利喉的功效?？芍委熆人浴⒀屎砟[痛、失音、外傷出血。由于野生資源有限，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)大馬勃子實(shí)體與發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌藥理活性進(jìn)行初步研究，為充分開(kāi)發(fā)大馬勃液體深層發(fā)酵的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

大馬勃Calvatiagigantean(Batsch ex Pers)，其子實(shí)體、菌株、發(fā)酵菌絲、發(fā)酵液，均由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥用真菌研究所提供。金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、腸埃希氏菌Escherichiacoli、綠膿假單胞菌Pseudomonasaeruginosa均為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)中心保藏的菌株。

1.1.2 藥品和試劑

阿司匹林25 mg·片-1，石家莊康力藥業(yè)有限公司(批號(hào)100933)；二甲苯(批號(hào)050510)，遼寧永強(qiáng)醫(yī)藥器械化玻有限公司試劑廠；地塞米松片0.75 mg·片-1，天津天藥藥業(yè)有限公司(批號(hào)H12020686)；冰醋酸(批號(hào)20090505)，北京化工廠；注射頭孢藥品(生產(chǎn)批號(hào)100702)，悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠共100只，雌雄兼有，清潔級(jí)，體重18 g～22 g，由長(zhǎng)春生物制品研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：(吉)2006-0001。

1.1.4 試儀器

迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠；101-1A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；YXQGO-280手提式高壓蒸汽消毒器，丹東市日用五金廠；TG328A型電子分析天平，上海儀器公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；游標(biāo)卡尺，規(guī)格(0～150) mm×0.02 mm，安徽桐城量具廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗炎、鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)供試品的制備

大馬勃子實(shí)體水提物：取大馬勃干燥子實(shí)體50 g，加適量水超聲提取2 h，將提取液濃縮至100 mL，備用(實(shí)驗(yàn)所用劑量均以生藥計(jì))。大馬勃發(fā)酵液干粉水提物：取發(fā)酵液干粉50 g，加100 mL水溶解，過(guò)濾，備用。大馬勃干燥菌絲體水提物：取干燥菌絲體100 g，方法同大馬勃子實(shí)體提取[1]。

1.2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹的試驗(yàn)

選擇健康昆明種小鼠50只，雄性，隨機(jī)分為5組，即模型組(生理鹽水)、阿司匹林(0.2 g·kg-1)組、大馬勃子實(shí)體水提物組(2.5 g·kg-1)、大馬勃發(fā)酵液水提物組(2.5 g·kg-1)、大馬勃菌絲體水提物組(5 g·kg-1)，每組10只，5組均連續(xù)灌胃給藥7 d，模型組給予等體積的生理鹽水。末次給藥3 min后，于小鼠右耳前后兩面均勻涂抹二甲苯0.02 mL·只-1，左耳不涂作為對(duì)照，45 min后脫頸處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8 mm的打孔器分別在左右耳相同位置打下圓耳片，于電子天平上稱取耳片重量，計(jì)算腫脹度和抑制率。腫脹度以每只小鼠左右耳片重量之差來(lái)表示，腫脹抑制率(P)用來(lái)比較各組動(dòng)物耳腫脹差異[2]，公式為：

P=[(d-d1)d]×100%

式中：d表示模型組腫脹度；d1表示給藥組腫脹度。

1.2.3 醋酸致小鼠的扭體試驗(yàn)

選用健康昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分組同“1.2.2”，陽(yáng)性對(duì)照組為地塞米松(1.56 mg·kg-1)組，每組10只，5組均連續(xù)灌胃給藥7 d，模型組給予相同體積的生理鹽水。末次給藥1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，0.2 mL·只-1，觀察記錄各組小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)，計(jì)算鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率(P1)用來(lái)比較各組動(dòng)物扭體次數(shù)差異(Li SH 1999)，公式為：

P1=(n-n1)n0×100%

式中：n表示模型組扭體次數(shù)；n1表示給藥組扭體次數(shù)；n0表示對(duì)照組扭體次數(shù)。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)供試品的制備

子實(shí)體提取物的制備：將干燥后的大馬勃子實(shí)體，粉碎，分別稱取15 g，共4份裝于250 mL的三角燒瓶中，用100 mL的水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、浸漬24 h，在水溫40℃、頻率60 Hz的超聲波清洗器中超聲60 min后抽濾，重復(fù)浸提3次，合并相同溶劑浸提的濾液，減壓回收溶劑至剩余量約5 mL時(shí)移入已稱重的小安瓿瓶中，于60℃水浴鍋上蒸干溶劑，再移入60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，制成干粉，稱重。菌絲體提取物的制備：將大馬勃干燥菌絲體，研成細(xì)粉，稱取15 g置于無(wú)菌安瓿瓶中，加入50 mL無(wú)菌水，于水溫40℃、頻率60 Hz的超聲波清洗器超聲60 min后靜置，過(guò)濾，重復(fù)提取3次，合并濾液，濃縮，干燥，稱重。發(fā)酵液提取物的制備：大馬勃發(fā)酵液干粉溶于水，可直接稱重溶解。

1.2.5 供試菌液的制備

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂2%。將保存的菌種活化，接入已滅菌后的新鮮培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或者48 h，備用。挑選生長(zhǎng)在瓊脂上的純菌落，直接用0.9%生理鹽水稀釋至9×108個(gè)·mL-1(參照麥?zhǔn)媳葷峁?。再1∶10稀釋成9×109個(gè)·mL-1。制備好的供試菌液備用。

1.2.6 抑菌濾紙片的制備

使用內(nèi)直徑為6 mm的打孔器在定性濾紙上均勻打孔，并且將濾紙片裝入50 mL的三角燒瓶中，塞上棉塞，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，60℃烘干。取大馬勃各提取物30 mg，分別用相應(yīng)的溶劑1 mL，制成30 mg·mL-1的樣品溶液，另配制質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的頭孢水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚，各1 mL為陰性對(duì)照溶液。在無(wú)菌環(huán)境下，將無(wú)菌濾紙片放入以上溶液當(dāng)中，浸泡3 h后，取出放入無(wú)菌平皿烘干備用。

1.2.7 抑菌圈的測(cè)定

在生物潔凈工作臺(tái)中，取直徑為90 mm無(wú)菌平皿，加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基30 mL，水平放置使其凝固，用滅菌后的涂布棒分別蘸取供試菌液(金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、綠膿假單胞菌)均勻涂布于平板培養(yǎng)基表面，待平板水分干燥后，使用三點(diǎn)接種法分別將抑菌濾紙片、陽(yáng)性和陰性對(duì)照的濾紙片用無(wú)菌鑷子夾取到測(cè)試菌平板上，然后倒置在培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量各濾紙片的抑菌圈直徑，根據(jù)有無(wú)抑菌圈及抑菌環(huán)直徑大小判定藥物抑菌效果[3]。

1.2.8 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用試管二倍稀釋法，將大馬勃各提取物準(zhǔn)確稱量0.5 g，溶于5 mL對(duì)應(yīng)溶劑當(dāng)中，使其充分溶解，分別對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、綠膿假單胞菌進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。方法為取12支滅菌、帶塞試管，編號(hào)1～編號(hào)12，每管加2 mL滅菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，然后于第1支試管中加入藥2 mL，混勻后吸取2 mL至第2管，第2管混勻后吸取2 mL至第3管，連續(xù)倍比稀釋至第10管，混勻后棄去2 mL；第11管不加藥物作為對(duì)照，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；第12管加入藥液2 mL，混勻棄去2 mL，不加細(xì)菌，觀察受試中藥是否有污染。向編號(hào)1～編號(hào)11的試管中各加入上述稀釋菌液0.1 mL，混勻，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以肉眼觀察，通過(guò)與11管、12管對(duì)比，不發(fā)生混濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC值[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大馬勃子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液抗炎鎮(zhèn)痛活性研究

2.1.1 大馬勃不同提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

不同提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

與模型組相比，各給藥組均明顯抑制耳廓腫脹，差異顯著(p<0.05，p<0.01)，所以在以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)實(shí)驗(yàn)劑量，大馬勃各組提取物對(duì)炎癥早期的組織腫脹均有顯著的抑制作用，其中大馬勃發(fā)酵液抗炎效果最佳(p<0.01)，子實(shí)體與菌絲體比較接近。

注：與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01；n=10。

2.1.2 大馬勃不同提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

不同提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01；n=10。

本實(shí)驗(yàn)采用的化學(xué)刺激致痛法觀察到，與模型組相比，地塞米松組、大馬勃子實(shí)體水提物組、大馬勃菌絲體水提物組和大馬勃發(fā)酵液水提物組均能減少小鼠扭體次數(shù)，差異顯著(p<0.05，p<0.01)，表明對(duì)醋酸引起的疼痛均有顯著抑制作用，同樣，大馬勃發(fā)酵液對(duì)疼痛的抑制作用最佳。

2.2 大馬勃子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液體外抑菌活性研究

2.2.1 大馬勃不同提取物體外抑菌研究

大馬勃子實(shí)體的水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚提取物分別為4.53 g、0.82 g、0.15 g、0.07 g。大馬勃菌絲干粉得到的水提物為0.12 g。抑菌結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，大馬勃子實(shí)體不同溶劑提取物中，乙醇提取物對(duì)3種供試菌均有抑菌作用，并且抑菌效果最強(qiáng)；其次是乙酸乙酯提取物；大馬勃水提物和乙醚提取物對(duì)綠膿假單胞菌均無(wú)抑菌作用；大馬勃發(fā)酵液產(chǎn)物和菌絲體對(duì)3種供試菌均有抑制作用，并且大馬勃發(fā)酵液產(chǎn)物抑菌作用明顯。說(shuō)明大馬勃子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵代謝產(chǎn)物中均含有能抑制金黃色葡萄球菌、大腸布氏桿菌、綠膿假單胞菌的活性物質(zhì)，而且菌絲體和發(fā)酵代謝產(chǎn)物與子實(shí)體的抑菌作用相近，可見(jiàn)它們含有相同或相似的具有廣譜抑菌作用的活性物質(zhì)。

2.2.2 大馬勃不同提取物最小抑菌濃度的測(cè)定

不同提取物最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，大馬勃不同提取物對(duì)3種供試菌有不同程度的抑菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌效果較好，發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、大馬勃子實(shí)體乙醇提取物的最小抑菌濃度(MIC)均為3.15。

3 討論

通過(guò)對(duì)大馬勃子實(shí)體及發(fā)酵代謝產(chǎn)物的提取物進(jìn)行抗炎、鎮(zhèn)痛和抑菌實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抗炎和鎮(zhèn)痛活性較強(qiáng)，說(shuō)明大馬勃菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后抗炎鎮(zhèn)痛作用有所增加。由于大馬勃子實(shí)體生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，而且考慮生物的可持續(xù)發(fā)展，可用大馬勃菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)代替對(duì)子實(shí)體的利用，這樣不僅節(jié)省資源，縮短時(shí)間，而且進(jìn)一步提高藥效，為大馬勃液體發(fā)酵產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了更多的科學(xué)依據(jù)。此外，通過(guò)對(duì)體外抑菌活性試驗(yàn)研究為抗菌藥物的篩選、抗菌譜的測(cè)定、藥價(jià)測(cè)定、提取過(guò)程的追蹤等提供了可供參考的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)提示大馬勃菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物可能成為工業(yè)化生產(chǎn)馬勃活性化合物的新來(lái)源，具有很好的臨床意義。

[1]錢海兵，孫宜春，黃婕，等. 芭蕉根不同提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(4)：780-781.

[2]白梅榮，圖雅，巴根那，等. 蒙藥那如-3抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2010，4(4)：35-37.

[3]呂平，黃強(qiáng). 苦丁茶不同提取物的體外抑菌作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(34)：16838-16840.

[4]蔡正軍，但飛君，陳國(guó)華，等. 紅毛七的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(35)：15541-15543.

Study on Anti-inflammatory and Analgesic and Bacteriostasis in Vitro ofCalvatiagigantean

ZHANG Fan1,2, WANG Da-ke1, LI Ai-xin1, WANG Shu-min1

(1.Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130117; 2.Border control command academay, Guangzhou Guangdong 510440)

The anti-inflammatory, analgesic and bacteriostatic activity effect of different extracts from the fruiting bodies, the mycelia and the broth ofCalvatiagiganteanwere evaluated, to provide the basis for further development ofCalvatiagigantean. Both of the extracts ofCalvatiagiganteancould reduce aurical swelling and inhibit twisting response of mice obviously, the broth ofCalvatiagiganteanwas best, and the inhibition rates were 42.9%, 43.69%, meanwhile the different extracts had different bacteriostatic activities as different degree, and theMICwas 3.15 mg·mL-1. The fruiting bodies and liquid fermentation metabolites ofCalvatiagiganteanhad certain analgesic action and anti-inflammation effect and antibacterial, then reasonable utilization of resources and industrialized production, available fermentation metabolites to replace the fruiting bodies ofCalvatiagiganteanrelated clinical effect.

Extract ofCalvatiagigantean; Analgesic action; Anti-inflammation effect; Bacteriostasis in vitro

張帆(1986-) ，女，藥劑師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail:289992174@qq.com

2014-01-15

S646.9

A

1003-8310(2014)02-0050-03

*通信作者：王淑敏，女，教授，主要從事中藥生物技術(shù)研究。