賀建超，賀聰瑩，盧美歡，馬英輝，王瑪麗

(1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

〈育種與馴化〉

雙孢蘑菇和姬松茸滅活原生質(zhì)體融合育種研究

賀建超1，賀聰瑩2，盧美歡1，馬英輝1，王瑪麗2

(1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

以雙孢蘑菇和姬松茸為親本菌株，通過滅活原生質(zhì)體融合，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，1株新的穩(wěn)定的雙孢蘑菇和姬松茸雜交高產(chǎn)菌株被選育出來。雙孢蘑菇原生質(zhì)體被熱滅活(65℃，30 min)，姬松茸原生質(zhì)體被紫外線滅活(30 w，30 cm，10 min)，雙親存活率為3.1×10-7～3.3×10-8。在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合繼續(xù)生存，親本原生質(zhì)體融合被實現(xiàn)，重組頻率為4.8×10-5。

雙孢蘑菇；姬松茸；滅活原生質(zhì)體；融合；重組子

自從1977年以來，人們開始了用滅活原生質(zhì)體進行微生物融合育種的嘗試[1]。雙孢蘑菇和姬松茸同是蘑菇屬不同種間的食用菌，為了將它們的優(yōu)良特性結(jié)合在一起，人工創(chuàng)造新品種，采用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，經(jīng)過多年的研究，得到了雙孢蘑菇和姬松茸融合重組子。對融合重組子進行了多代選育，獲得了性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交新菌株。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)2796-1、姬松茸(Agaricusblazei)M1，均系陜西省微生物研究所保藏菌株。

1.2 供試培養(yǎng)基

綜合PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、葡萄糖20 g、維生素B110 mg、瓊脂粉20 g，蒸餾水 1 000 mL；再生培養(yǎng)基(RM)：綜合PDA培養(yǎng)基加入甘露醇0.6 mol；液體再生培養(yǎng)基(LRM)：綜合PDA培養(yǎng)基不加瓊脂粉，另外加入硫酸鎂0.6 mol。

1.3 混合酶液

中科院生物物理所生產(chǎn)的蝸牛酶10 mg·mL-1，中科院上海生化所生產(chǎn)的纖維素酶10 mg·mL-1，用0.6 mol硫酸鎂作等滲液，pH5.8磷酸鹽緩沖液配制。酶溶解后 5 000 r·min-1，離心10 min去掉沉淀雜質(zhì)，上清液再用滅菌G6漏斗過濾除菌。

1.4 融合劑

用0.6 mol硫酸鎂和0.01 mol氯化鈣配制的30%聚乙二醇(PEG)，分子量為 6 000D(日本進口分裝)。滅菌備用。

1.5 原生質(zhì)體的分離與再生

收集25℃三角瓶液體培養(yǎng)6 d～8 d菌絲體1 g，加10 mL混合酶液輕微震蕩，在小三角瓶中酶解脫壁。30℃水浴酶解4 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最高峰。G3漏斗過濾殘余菌絲體，用0.6 mol·L-1硫酸鎂洗滌2次，收集原生質(zhì)體懸浮液20 mL。用血球計數(shù)器計數(shù)，雙孢蘑菇原生質(zhì)體濃度為3.6×108個·mL-1，姬松茸原生質(zhì)體濃度為3.4×108個·mL-1。

將制備的原生質(zhì)體懸浮液分別用液體再生培養(yǎng)基和無菌水稀釋，25℃預(yù)培養(yǎng)24 h，取0.1 mL涂布于再生平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)8 d～10 d，兩者菌落數(shù)之差，除以顯微計數(shù)原生質(zhì)體數(shù)，即為原生質(zhì)體再生頻率。雙孢蘑菇和姬松茸原生質(zhì)體再生頻率分別為2.4%和2.1%[2]。

1.6 原生質(zhì)體滅活與融合

取雙孢蘑菇原生質(zhì)體懸浮液10 mL，65℃水浴滅活30 min，檢測存活率為3.1×10-7；取姬松茸原生質(zhì)體懸浮液10 mL倒入直徑20 cm 無菌平皿中，在30 W紫外燈管正下方30 cm 處，打開皿蓋照射滅活處理10 min，檢測存活率為3.3×10-8。

將兩親株滅活的原生質(zhì)體各取1 mL混合到無菌帶塞的離心管內(nèi)，加入1 mL 30℃預(yù)熱的聚乙二醇，2 000 r·min-1離心20 min，30℃溫浴10 min，以5 mL 0.6 mol·L-1硫酸鎂洗滌2次，再用液體再生培養(yǎng)基作系列稀釋，25℃預(yù)培養(yǎng)24 h，取0.1 mL 涂布平板再生培養(yǎng)基，25℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d～10 d，挑選融合重組子再生菌株60株，移接于綜合PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)滿管，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活原生質(zhì)體融合頻率

雙孢蘑菇2796-1和姬松茸M1原生質(zhì)體分別采用熱滅活和紫外線滅活法處理，混合后在聚乙二醇誘導(dǎo)下發(fā)生融合，融合后重組頻率為4.8×10-5。

2.2 融合重組子鑒定

拮抗作用：在60株融合子中有85%的菌株與雙親菌株形成了明顯的拮抗線，融合子之間也有拮抗但不明顯。

出菇試驗：雙孢蘑菇2796-1和姬松茸M1融合子從F1～F3代性狀分離，其規(guī)律不同于孟德爾分離規(guī)律[2]。取典型的雙親性狀的子實體做組織分離，進行純化培養(yǎng)。繼續(xù)栽培6次，觀察選擇獲得了性狀穩(wěn)定的雙孢蘑菇和姬松茸雜交高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌株。新菌株菌絲潔白粗壯，生長速度快。子實體形態(tài)和顏色介于兩親本之間，麥草牛糞發(fā)酵培養(yǎng)料栽培周期為6個月，每千克干料可產(chǎn)鮮蘑菇0.54 kg。有顯著的雜交優(yōu)勢，抗雜菌能力超過雙親菌株。

2.3 融合重組子分析

雙孢蘑菇和姬松茸采用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)可以獲得理想的雜交新菌株。選擇親緣關(guān)系較遠，且具有互補優(yōu)勢的菌株為親本，有利于雜交優(yōu)勢的體現(xiàn)[4]。雙親滅活原生質(zhì)體融合的特點是可以省去遺傳標記菌株的篩選，還有利于排除雙方親本類型的再生菌株的干擾，便于選擇融合重組子。熱滅活必須配合其它滅活方式，雙親菌株原生質(zhì)體均用熱滅活法處理，致死損傷部位都一樣，融合后得不到互補，就得不到融合子再生菌株。雙親菌株原生質(zhì)體均用紫外線滅活法處理。又會通過UV處理在不同位點上損傷DNA，因而有可能使融合子的某些代謝途徑受到干擾，或許影響產(chǎn)量。但它可以刺激雙親菌株基因組間的交換，這是紫外線滅活法的優(yōu)點。因此，我們選用了雙孢蘑菇原生質(zhì)體熱滅活，姬松茸原生質(zhì)體紫外線滅活，融合后雙方原生質(zhì)體損傷部位得到互補，我們就很容易從再生平板上，挑選出融合子再生菌株。

[1]周東坡，平文祥. 微生物原生質(zhì)體融合[M]. 哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1990：301-304.

[2]劉振岳，泰立芳，張偉. 細胞工程株平香1號培育簡報[J]. 食用菌，1995(6)：7-8.

[3]賀建超，賀榆霞. 木耳滅活原生質(zhì)體融合育種研究[J]. 中國食用菌，2003，22(5)：16-17.

[4]張樹庭，林方燦. 蕈菌遺傳與育種[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：96.

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Study on the Breeding ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeiby Inactivated Protoplast Fusion

HE Jian-chao1, HE Cong-ying2, LU Mei-huan1, MA Ying-hui1, WANG Ma-li2

(1.Shaanxi Institute of Microbiology, Xi’an Shanxi 710043; 2.College of Life Science, Northwest University, Xi’an Shanxi 710069)

In this study, a new steady, high-yield strain was obtained by inactivated protoplast fusion of the parent strain ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeithrough primary and secondary screening.AgaricusbisporusandAgaricusblazeiprotoplast was inactivated with heating (65℃, 30 min) and UV light (30 w, 30 cm, 10 min) respectively. The livability of both was about 3.1×10-7～3.3×10-8. By the inducer of polyethylene glycol, the parent protoplast fusion was carried out with a recombination freguency of 4.8×10-5.

Agaricusbisporus;Agaricusblazei; Inactivated protoplasts; Fusion; Recon

賀建超(1963-)，男，副研究員，長期從事食用菌遺傳育種工作。

2013-11-16

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0009-02