■馬玉和 王慶奎 郭永軍 尤宏爭 孫學亮 成 希

（1.天津海升水產養(yǎng)殖有限公司，天津 300270；2.天津農學院水產學院天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；3.天津市水產研究所，天津 300221）

嗜水氣單胞菌與遲緩愛德華氏菌廣泛存在于自然環(huán)境中，是魚類常見的致病菌。其中，致病性嗜水氣單胞菌可感染人和各種動物。目前對由嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌感染引起的水產動物相關疾病的防控和治療，仍主要依賴傳統(tǒng)的化學消毒劑、抗生素。長期使用這些藥物，不僅使致病菌的耐藥性不斷增強，而且也導致養(yǎng)殖動物體內藥物殘留量日趨增多，最終因藥物積蓄而導致魚類以及水環(huán)境被污染[1]。近年來，大量研究表明，中草藥可以用于防治細菌性傳染病。中草藥是一種天然環(huán)保型綠色藥物，具有高效、毒副作用少、安全性高、殘留少等諸多優(yōu)點。目前，用中草藥代替抗生素是水產病害防治的發(fā)展趨勢，因此研究中草藥對致病菌的作用效果、抑制殺滅機理等具有重要的意義。

有關中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌抑制作用研究比較多[2-6]。本試驗通過五種中草藥的抑菌試驗，研究五種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的影響，旨在尋求一種健康綠色的藥物來治療遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌引發(fā)的疾病，并以此指導生產，為細菌性疾病防治提供參考依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌及菌液制備

本試驗遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌是由天津農學院天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室提供。將其分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用生理鹽水沖洗培養(yǎng)基獲得菌液，放入4℃冰箱中保存供試驗使用。之后使用時以生理鹽水稀釋，用麥氏濁度儀確定菌液濁度為0.5。

1.1.2 M-H培養(yǎng)基與中草藥

M-H培養(yǎng)基為天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室提供。

五倍子(Rhus chinensis)、黃芩(Scutellaria baicalensis)、訶子（Terminalia chebula）、烏梅（Prunus mume）、石榴皮（Punica granatum）五種中草藥購自天津市某大藥房，將中草藥粉碎裝于封口塑料袋中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗藥物的制備

五倍子、黃芩、訶子、烏梅、石榴皮五種中草藥各取10 g放入燒杯中，各加200 ml的蒸餾水，浸泡30 min后加熱煎煮，邊煮邊用玻璃棒攪動，待煮沸后用文火煮30 min，過濾出藥液，然后再加水煎煮，共煎煮三次。合并三次所得藥液，再次過濾出雜質后，加熱濃縮至1 g/ml，放入4℃冰箱中保存供試驗使用，使用前充分振蕩。

1.2.2 試驗藥敏紙片的制備

用打孔器在濾紙上打孔，制備直徑為6 mm的圓形濾紙片，放試管中經高壓滅菌鍋滅菌，烘干。烘干后，在超凈工作臺中，將濾紙片放入培養(yǎng)皿中，分別吸取5種藥液加入其中，同時加蒸餾水作空白對照組，共6組，充分浸泡吸收，制成藥敏紙片，每片紙片的含藥量約為10 mg。

1.2.3 藥物抑菌試驗設計

采用紙片瓊脂擴散法(K-B紙片擴散法)，分別配制添加不同鹽度鹵水的M-H培養(yǎng)基（遲緩愛德華氏菌組為0、10、20、30、40；嗜水氣單胞菌組為0、1、2、3、4），在M-H培養(yǎng)基上，分別取100 μl菌懸液均勻涂布于平板，用滅菌鑷子以無菌操作取出制備好的中草藥藥敏紙片貼在涂布有細菌的平板培養(yǎng)基表面,貼片時輕輕按壓,使藥片與培養(yǎng)基密切接觸。每個平板上貼五個藥敏紙片，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃條件下培養(yǎng)24 h，然后測定抑菌圈的直徑，記錄，每個抑菌圈在兩個方向各測量兩次，取其平均值。中草藥抑菌效果等級劃分：抑菌圈直徑小于8 mm為無抑菌作用；8～11 mm為弱抑菌作用；11～16 mm為中等抑菌作用；16 mm以上為強抑菌作用。

1.2.4 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據用SPSS軟件做單因素方差分析，差異顯著者用Duncan's法做多重比較，顯著性水平為P＜0.05。表中數(shù)據用“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 不同鹽度下5種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑菌直徑比較（見表1）

表1 不同鹽度下5種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑菌直徑比較

由表1可知，不同鹽度下5種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑菌直徑可以看出，在其它條件相同，鹽度不同的情況下，抑菌圈的情況也有明顯不同。其中在添加鹽度為0時，對遲緩愛德華氏菌的抑制作用由強到弱依次為五倍子、訶子、黃芩、烏梅、石榴皮；在添加鹽度為10時依次為五倍子、訶子、石榴皮、烏梅、黃芩。而在添加鹽度為20時，依次為訶子、五倍子、石榴皮、黃芩、烏梅；在添加鹽度為30時，抑制作用由強到弱依次為訶子、五倍子、石榴皮、烏梅、黃芩；在添加鹽度為40時，則是訶子、烏梅、黃芩、五倍子、石榴皮。由此表明：對于相同鹽度，低鹽條件下，五倍子的抑菌作用明顯強于其它四種，而在高鹽條件下，訶子的抑菌作用要明顯強于其它四種。隨著鹽度的增加，這五種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑制作用都有所增強，抑菌圈直徑大于11.00 mm，抑菌效果明顯，以訶子最為明顯。不同鹽度條件下，五倍子、訶子、黃芩具有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在都11 mm以上。

2.2 不同鹽度下5種中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌直徑比較（見表2）

表2 不同鹽度下5種中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌直徑比較

由表2可知，不同鹽度下5種中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌直徑可以看出，在其它條件相同，鹽度不同的情況下，抑菌圈的情況也有明顯不同。其中在添加鹽度為0時，對嗜水氣單胞菌的抑制作用由強到弱依次為五倍子、石榴皮、訶子、黃芩、烏梅；在添加鹽度為1時依次為五倍子、石榴皮、訶子、烏梅、黃芩。而在添加鹽度為2時，依次為五倍子、訶子、烏梅、石榴皮、黃芩；在添加鹽度為3時，抑制作用由強到弱依次為五倍子、石榴皮、烏梅、黃芩、訶子；在添加鹽度為4時，則是五倍子、烏梅、訶子、石榴皮、黃芩。由表2可知，在不同鹽度條件下，五倍子的抑菌作用都明顯強于其它四種，抑菌圈大于14 mm。其它四種中草藥抑菌效果較弱，抑菌圈小于10.00 mm。烏梅對嗜水氣單胞菌的抑制作用有所增強。

3 討論

3.1 同一鹽度下中草藥對致病菌抑菌效果的比較

對于遲緩愛德華氏菌，M-H培養(yǎng)基添加不同鹽度鹵水分別為0、10、20、30、40五個梯度。從表1可知，在0、10鹽度條件下，五倍子的抑菌作用明顯強于其它四種，而在20、30、40鹽度條件下，訶子的抑菌作用要明顯強于其它四種中草藥。對于嗜水氣單胞菌，M-H培養(yǎng)基添加不同鹽度鹵水分別為0、1、2、3、4五個梯度。從表2可以看到，在相同鹽度條件下，五倍子的抑菌作用都明顯強于其它四種，抑菌圈大于14.00 mm。5種中草藥對兩種菌的抑菌比較，從表1和表2中可見，對于同一鹽度下，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈可以看出：在相同條件下，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均存在不同程度的抑制作用。其中五倍子對這兩種細菌都具有較強的抑制作用，而訶子和黃芩對遲緩愛德華氏菌具有明顯抑菌效果，抑菌圈直徑均大于11.00 mm；對嗜水氣單胞菌效果卻一般。石榴皮和烏梅的抑菌效果一般，烏梅對遲緩愛德華氏菌的抑制作用則強于嗜水氣單胞菌。

3.2 不同鹽度對中草藥抑菌效果的影響

對于遲緩愛德華氏菌，隨著鹽度的增加，這五種中草藥的抑制作用都有所增強，抑菌效果明顯，其中以訶子最為明顯。不同鹽度條件下，五倍子、訶子、黃芩具有明顯抑菌作用，抑菌圈都在11 mm以上。對于嗜水氣單胞菌，在不同鹽度下五倍子的抑菌作用都明顯強于其它四種；隨著鹽度的增加，烏梅的抑制作用有所增強，而其它四種都有所減弱。上述結果的出現(xiàn)，可能是由中草藥的藥性所決定的，五倍子對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均具有較好的抑菌和殺菌效果。在上述試驗中，雖然鹽度增加，但五倍子的抑菌效果依然明顯。其它四種則表現(xiàn)不一，或隨鹽度增長抑菌效果增強，或隨鹽度增長而減弱。

3.3 不同中草藥抑菌試驗研究方法對抑菌效果的影響

本試驗以遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌供試菌，用5種中草藥煎液對其進行了抑菌試驗。在相同條件下，遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌對不同的中草藥煎液的耐受程度存在較大差異。其中五倍子對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均具有較好的抑菌和殺菌效果；訶子和黃芩對遲緩愛德華氏菌具有明顯抑菌效果，對嗜水氣單胞菌效果卻一般。這與姜巨峰等[6]研究中草藥試驗中五倍子對嗜水氣單胞菌有較強的抑菌效果、陳言峰等[7]研究中草藥對遲緩愛德華氏菌的體外抗菌活性試驗中五倍子抑菌作用明顯的結論一致。這些結果的出現(xiàn)，可能與中草藥的藥性有關，五倍子富含鞣質，能夠凝固微生物體內的原生質，同時含有多種酶能夠對多種細菌起抑制作用[8]。

研究中草藥抑菌效果有多種方法，如體外法、體內法，還有攻毒試驗等研究方法；體內法又分為喂食、注射、藥浴等；而攻毒試驗也可分先感染再治療，先預防再感染兩種。中草藥的提取工藝也可分為多種，如水溫浸法、稀堿（酸）溶液溫浸法、乙醇回流法等，不同的提取工藝對研究試驗結果也會產生很大影響[9]。本試驗中草藥提純采用水煎法，多次煎煮可能會對中草藥中所含活性物質造成破壞。關于這幾種中草藥的醇提物對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果是否相同，尚需進一步研究討論。測定中草藥抑菌強弱的方法有瓊脂擴散法和二倍稀釋測最小抑菌和最小殺菌濃度法等。本試驗采用瓊脂擴散法(K-B紙片擴散法)，在M-H培養(yǎng)基上進行試驗，M-H培養(yǎng)基能大大提高抑菌試驗的靈敏度，避免以往所用營養(yǎng)瓊脂中某些成分與中草藥抗菌物質結合而鈍化藥物的抗菌作用[10]。

本試驗通過將5種中草藥五倍子、烏梅、石榴皮、黃芩和訶子分別制成藥敏紙片，然后進行藥敏紙片抑菌試驗，結果表明：五倍子對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均具有較好的抑菌和殺菌效果，在不同鹽度條件下效果都比較穩(wěn)定，所以可以作為一種海水、淡水環(huán)境下通用藥物來開發(fā)使用。隨著鹽度的增加，五種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑制作用都有所增強，以訶子最為明顯。其對嗜水氣單胞菌則表現(xiàn)不一，或隨鹽度增長抑菌效果增強，或隨鹽度增長而減弱的。在不同鹽度條件下，同種中草藥對同種細菌具有不同的抑制和殺滅作用，這可以為針對特定鹽度環(huán)境的水體，開發(fā)高效藥物提供依據；同時也可確定藥物的最佳使用環(huán)境條件，防止不必要的浪費及影響?zhàn)B殖生產。