張 亮，付崇羅

常規(guī)的膜片鉗技術(shù)采用負壓抽吸或電擊破膜形成全細胞模式。在此過程中，電極內(nèi)液和細胞內(nèi)液之間的擴散交換常使一些受胞內(nèi)物質(zhì)調(diào)控的通道電流出現(xiàn)時間依賴性的衰減。1988年Horn等［1］對傳統(tǒng)全細胞記錄進行了改進，建立了穿孔膜片鉗技術(shù)（perforated-patch clamp）：即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性質(zhì)，將這類抗生素充灌在電極液中，在高阻封接形成之后自發(fā)性形成的全細胞模式。

海德氏突觸（calyx）位于哺乳動物聽覺腦干斜方體中核區(qū)，是一個巨大的谷氨酸能化學(xué)突觸，越來越多的被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）突觸機制的研究［2］。本研究室在小鼠calyx細胞上研究突觸囊泡釋放機制，然而在常規(guī)全細胞膜片鉗記錄時，易引起細胞內(nèi)物質(zhì)流失，影響細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而可能導(dǎo)致記錄的失真，尤其是在要求長時間記錄的實驗中。而穿孔膜片鉗技術(shù)應(yīng)用amphotericin B在細胞膜上形成特定的孔道，選擇性地允許一些離子和大分子物質(zhì)通過，保持了電學(xué)連續(xù)性，從而使細胞內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定，在一定程度上彌補了上述缺陷，實驗成功率也相應(yīng)提高，為深入開展后續(xù)的工作提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 腦片的制備

本實驗使用7-9日齡的 C57BL6小鼠，發(fā)育正常，雌雄不限。制備含有聽覺腦干斜方體中核區(qū)組織腦片，厚度200μm。腦片置于盛有Bath溶液并通有二元氣（95%O2＋5%CO2）的水浴槽中，37℃溫浴30 min。

1.2 電極拉制和電極液灌注

微管電極是由電極拉制儀（MODEL P-2000，USA）拉制而成，充灌電極液后，電極尖端阻值為2～4 MΩ。拉制好的電極先在不含amphotericin B的電極液中浸10～30 s，然后從電極尾部反向充灌含amphotericin B的電極液，用手指輕彈電極中部排除尖端氣泡。新配制的amphotericin B電極內(nèi)液一般使用時間不要超過3～5 h，否則破膜效率將降低。

1.3 mEPSC記錄方法

鉗制電壓-80 mV，采樣頻率為20 KHz，信號通過5 KHz過濾。記錄使用的膜片鉗放大鏡（EPC10，HEKA，Germany），通過模數(shù)轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，存于計算機硬盤。

1.4 藥物和配制液體

1.4.1 藥物 amphotericin B購于 CALBIOCHEM公司（USA），其它藥品均購自 Sigma公司（USA）。

1.4.2 配制液體（mmol／l） 低鈣人工腦脊液（slicing solution）NaCl 125，NaHCO325，NaH2PO41.25，KCl 2.5，CaCl20.5，MgCl23，Glucose 25，Ascorbic acid 0.4，Na-Pyruvate 2，MyO-Inositol 3。標(biāo)準(zhǔn)人工腦脊液（mmol／l）NaCl 125，NaHCO325，NaH2PO41.25，KCl 2.5，CaCl22，MgCl21，Glucose 25，Ascorbic acid 0.4，Na-Pyruvate 2，MyO-Inositol 3。電極內(nèi)液（mmol／l）KCl 150，HEPES-NaOH 10，P-creative 10，MgATP 4，EGTA 0.5，GTP 0.3。Amphotericin B穿孔液的配制：避光條件下稱取3 mg amphotericin B加入50μl DMSO，應(yīng)用超聲震蕩加速溶解至其呈現(xiàn)澄清透明的橙黃色液體，然后取適量加入到電極液中使Amphotericin B的最終濃度為 240～400μg／ml。Amphotericin B儲存液（60 mg／ml）避光保存在-20℃?zhèn)溆?，保存時間不超過1個星期。整個配制過程避光，用棕色瓶配制或用錫箔紙包裹。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用 IGOR Pro 6.22A（WaveMatrics）軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，所獲數(shù)據(jù)采用組間 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 穿孔過程的動態(tài)變化

在施加正壓的情況下，利用三維操縱器移動電極貼近目標(biāo)細胞，并輕壓在細胞表面，稍加負壓即可形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接。一般情況下，當(dāng)電極與細胞膜形成帖附式膜片后，約幾分鐘amphotericin B即可擴散到細胞膜上發(fā)揮作用。每隔10 min施加一個10 mV的超極化脈沖，同時觀察電容電流幅值的變化。高阻封接5 min后，可觀察到脈沖誘發(fā)的電容電流幅值逐漸增大，電極的串聯(lián)電阻（Rs）逐漸減小，即amphotericin B形成的孔道越來越多。約在高阻封接后30 min左右電容電流和串聯(lián)電阻（Rs）趨于穩(wěn)定，表明孔道已完全形成（圖1）。

Fig.1 Dynamic changes in the capacitance currents of perforated membrane of calyx cells

2.2 Amphotericin B在穿孔膜片鉗記錄中的一般特性

成功的穿孔全細胞模式記錄過程中，細胞穩(wěn)定的鉗制在-80 mV的靜息電位上，電極的串聯(lián)電阻（Rs）小于70 MΩ且相對穩(wěn)定，可以記錄30 min以上。在記錄過程中，穿孔全細胞模式有時候會自發(fā)性變成傳統(tǒng)全細胞模式，amphotericin B會擴散進入細胞質(zhì)，這種情況將會引起串聯(lián)電阻（Rs）迅速下降到20 MΩ以下（圖2）。我們在監(jiān)測整個記錄過程中串聯(lián)電阻（Rs）的變化，只有極少的細胞出現(xiàn)串聯(lián)電阻（Rs）的變化，這些記錄的細胞數(shù)據(jù)將被丟棄。

Fig.2 Membrane current（○）and series resistance（?）dynamic property at perforated patch clamp mode

2.3 Amphotericin B的濃度對穿孔過程的影響

Amphotericin B的濃度是影響細胞穿孔過程的重要因素，為了獲得最佳的穿孔條件，我們探索了Amphotericin B的不同濃度對細胞穿孔過程的影響。本組實驗設(shè)定了不同的amphotericin B的濃度（200，300和400μg／ml）來優(yōu)化最佳的穿孔濃度。Amphotericin B的濃度在400μg／ml時串聯(lián)電阻（Rs）和穿孔時間最佳。如果繼續(xù)增加amphotericin B的濃度將會出現(xiàn)絮狀沉淀，影響封接的成功率和穿孔效果（圖3）。

Fig.3A Effects of amphotericin Bconcentrations on the series resistance（Rs）

Fig.3B Effects of amphotericin B concentrations on the time of perforation

2.4 采用穿孔膜片鉗和全細胞膜片鉗方法全細胞模式記錄神經(jīng)元突觸內(nèi)自發(fā)的微小興奮性突觸后電流（mEPSC）

分別在傳統(tǒng)全細胞模式和穿孔全細胞模式下記錄mEPSC，分析發(fā)現(xiàn)常規(guī)的全細胞模式記錄的mEPSC頻率下降明顯，而穿孔全細胞模式mEPSC下降相對緩慢。記錄6 min的 mEPSC，對比前 3min和后3min平均頻率的下降率分別為（17.2±2.73）%（n＝3）和（52.8±9.59）% （n＝3），兩組數(shù)據(jù)經(jīng)組間 t檢驗差異有顯著性（P＜0.05，圖 4）。

Fig.4A The mEPSCresults of the records under perforated wholecell mode and conventional whole-cell mode in the calyx cells

Fig.4B Comparision of frequency of mEPSCdecay between perforated whole-cell mode and conventional whole-cell mode

3 討論

穿孔膜片鉗法［3］的特點是不打破電極腔下的細胞膜片，而利用在細胞膜上形成高離子通透的小孔來構(gòu)成通電性回路。小孔的大小只允許一價離子通過，而不允許大分子通過，所以它具有不破壞細胞內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點。

本實驗研究了穿孔過程的動態(tài)變化，穿孔膜片鉗記錄的一般特性，amphotericin B的濃度對穿孔過程的影響，全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法記錄mEPSC四個方面。研究表明，當(dāng)電極與細胞膜形成高阻封接后，10 min左右amphotericin B可擴散到細胞膜上，30 min內(nèi)形成穩(wěn)定穿孔模式。在記錄過程中，如果監(jiān)測到串聯(lián)電阻（Rs）迅速下降到20 MΩ以下，有可能是穿孔全細胞模式自發(fā)性變成傳統(tǒng)全細胞模式。成功的穿孔全細胞模式記錄過程中，串聯(lián)電阻（Rs）小于70 MΩ且趨于穩(wěn)定，細胞可以穩(wěn)定記錄1～2 h，而無常規(guī)全細胞膜片鉗記錄時破膜后電極尖端的細胞碎片重新堵住電極口引其記錄電流畸變之虞。我們摸索了最佳的amphotericin B濃度，研究結(jié)果表明amphotericin B濃度在400μg／ml可以更快更有效的穿孔，如果繼續(xù)增加濃度，會出現(xiàn)絮狀沉淀，可能是amphotericin B過飽和導(dǎo)致，影響封接和穿孔的進程。在記錄mEPSC的過程中，我們發(fā)現(xiàn)穿孔膜片鉗方法可以更穩(wěn)定的記錄神經(jīng)元的電生理特性。此方法與常規(guī)膜片鉗相比的優(yōu)點為：（1）大分子不能通過由amphotericin B形成的孔道，因而可避免常規(guī)膜片鉗記錄時細胞內(nèi)重要物質(zhì)滲析的影響。通道電流的衰減現(xiàn)象顯著減慢，那些對離子通道有調(diào)控作用的胞內(nèi)第二信使及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)仍能不受影響的發(fā)揮其作用；（2）Amphotericin B形成的孔道對多價離子不通透，故細胞內(nèi)這些離子濃度不受電極內(nèi)液的影響；（3）對細胞的損傷小，高阻封接不易破壞，記錄可持續(xù)時間長［4，5］。

本研究摸索出了一種穩(wěn)定的穿孔膜片鉗全細胞記錄技術(shù)，可以更有效，更真實的反應(yīng)神經(jīng)元通道電流的電生理特性。該技術(shù)適用于記錄時程較長或電流有rundown現(xiàn)象的實驗，特別是涉及胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制研究的實驗。

［1］ Horn R，Marty A.Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method［J］.J Gen Physiol，1988，92（2）：145-159.

［2］ Schneggenburger R，F(xiàn)orsythe ID.The calyx of Held［J］.Cell Tissue Res，2006，326（2）：311-337.

［3］ 陳 軍.膜片鉗實驗技術(shù)系列講座［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1995，11（Pt 2）：170-184.

［4］ 王 華，李 濤，曾曉榮，等.兩性霉素B與β-escin混合穿孔電極液在人心房肌細胞SK2電流記錄中的應(yīng)用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（3）：214-218.

［5］ 崔文玉，張穎麗，殷曉峰，等.培養(yǎng)的大腦皮層海馬及交感神經(jīng)細胞鈉 鉀和鈣離子通道的全細胞記錄技術(shù)［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21（1）：105-109.