王奇敏，董 慧，張 成，張永鶴，馬 靖Δ，王廣發(fā)

近年來，睡眠呼吸暫停綜合征（sleep apnea syndrome，SAS）因其發(fā)病率高、產(chǎn)生多系統(tǒng)損害并影響患者預(yù)后而受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界廣泛重視，其發(fā)病機(jī)制尤其是中樞機(jī)制研究是目前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)之一。睡眠呼吸暫停動物模型是SAS機(jī)制研究的重要手段，大鼠是睡眠呼吸暫停的天然動物模型，本研究室在國內(nèi)首先建立了大鼠睡眠呼吸監(jiān)測技術(shù)［1］，并進(jìn)行了許多相關(guān)基礎(chǔ)研究工作。在近年使用過程中，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有監(jiān)測技術(shù)仍存在手術(shù)創(chuàng)面大、連續(xù)監(jiān)測失敗率高、信號不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，因此我們在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的動物模型技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)長時間監(jiān)測，具有操作簡單、信號穩(wěn)定的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD成年大鼠，北京聯(lián)合利華動物中心實(shí)驗(yàn)動物中心提供。自由食水，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度40%，12 h∶12 h的明暗周期（8∶00～20∶00開燈；20∶00～8∶00熄燈），適應(yīng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器

成都泰盟公司BL-420多導(dǎo)生理儀及睡眠呼吸分析系統(tǒng)，美國Honeywell 1英寸水柱微壓傳感器，腦立體定位儀，臺灣寶工微型電鉆，Pentium IV PC機(jī)。體描箱制作方法參照本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)［1，2］（圖 1）

1.3 監(jiān)測電極

以往應(yīng)用8孔電路板及導(dǎo)線制作監(jiān)測腦電（ECoG）和肌電（EMG）電極 （圖 2），需要操作者事先人工制備，元件質(zhì)量不穩(wěn)定，電極安置時手術(shù)創(chuàng)面大、固定困難，容易在留置過程中被大鼠搔抓損壞。現(xiàn)在改用以?1 mm消毒不銹鋼螺絲作為ECoG電極［3］，固定于頭骨（圖3），深度以不透硬腦膜為宜。

Fig.3 Stainless steel screw as ECoG electrodes

1.4 動物手術(shù)

大鼠睡眠監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中，手術(shù)是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，所以手術(shù)部分為改進(jìn)的重要方面之一。改進(jìn)后，手術(shù)時間縮短，創(chuàng)面暴露時間減少，創(chuàng)面小，電極穩(wěn)固。具體方法如下：5%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）腹腔麻醉大鼠。阿托品（1 ml／kg）腹腔注射以減少氣道分泌物。顱頂部皮膚剃毛消毒后，沿矢狀線做一切口，大約1.5～2.0 cm（大約從兩眼后角連線到兩耳前沿連線），暴露頭骨，30%雙氧水清潔顱骨表面，以便觀察前囟、矢狀縫、人字縫等。安裝EEG電極：以十字縫為坐標(biāo)軸原點(diǎn)，大鼠腦立體定位儀確定4個ECoG電極的坐標(biāo)位置，分別記為（0.20，0.25）、（-0.40，-0.40）、（0.40，-0.40）、（-0.20，0.25）（單位：cm）。用微型電鉆在以上坐標(biāo)點(diǎn)鉆孔，鉆透顱骨即停止，勿損傷硬腦膜。將4個1 mm消毒不銹鋼螺絲作為ECoG電極，固定于頭骨。分離頸背部肌肉，將預(yù)先制作的2根EMG電極的導(dǎo)線用手術(shù)縫針引入頸部肌肉中，打結(jié)固定。上述腦電和肌電導(dǎo)線的另一端事先已焊接在一個6針小插座上。用牙托水泥將小插座固定在顱骨適當(dāng)位置。手術(shù)完成后肌注104U青霉素以防術(shù)后傷口感染。腹腔注射地塞米松0.3 ml預(yù)防腦水腫。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)恢復(fù)1周，飼養(yǎng)條件同前。

1.5 監(jiān)測裝置的連接

改進(jìn)前使用自制導(dǎo)線，存在耗時且導(dǎo)線容易纏繞打結(jié)、傳導(dǎo)信號不穩(wěn)定及壽命短的缺點(diǎn)。改進(jìn)后使用6根直徑1mm鍍銀耐高溫線（圖4）將大鼠ECoG和EMG傳入監(jiān)測裝置。附有6根導(dǎo)線的插頭與對應(yīng)大鼠頭上6孔插針的插座連接，6根導(dǎo)線擰成一股后穿入輕質(zhì)塑料保護(hù)管后從監(jiān)測盒的盒蓋橡皮塞中穿出，另一端去漆與多導(dǎo)生理儀對應(yīng)導(dǎo)聯(lián)的輸入端連接。使用持續(xù)正壓通氣呼吸機(jī)向監(jiān)測盒內(nèi)通入2 L／min的新鮮空氣，流入和流出空氣的橡皮管分別長2米和1米，以保證流入、流出氣流的平穩(wěn)。微壓傳感器一端與體描箱上的小孔相連，另一端通過塑料管與大氣相通，輸出信號接多導(dǎo)生理儀輸入端。

Fig.4 Silver plated cable connecting electrodes and monitoring devices

1.6 信號采集、呼吸事件及睡眠事件分析

Fig.5 Normal respiratory wave and two types of apnea of rat

信號采集使用之前經(jīng)典方法［1，2］，其標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)性好，可靠，是公認(rèn)的方法。呼吸事件及睡眠分析方法具體參照既往文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)［2，4］。大鼠兩種呼吸暫停的波形：嘆息后呼吸暫停（post sign apnea，PS）和自發(fā)呼吸暫停（spontaneous apnea，SP），如圖 5所示。清醒（wake）、非快動眼睡眠（non rapid-eye-movement sleep，NREM）及快動眼睡眠（rapid-eye-movement sleep，REM）期圖形如圖6所示。

Fig.6 Different EcoGand EMG waves in wake／sleep states

2 結(jié)果

本研究主要從監(jiān)測電極、信號接入線路及動物手術(shù)三方面改進(jìn)了大鼠睡眠呼吸監(jiān)測技術(shù)。改進(jìn)后手術(shù)時間縮短，創(chuàng)面暴露時間減少，大鼠術(shù)后易恢復(fù)。且電極穩(wěn)固性好，信號接入線路傳導(dǎo)性好，耐用。腦電和肌電信號更穩(wěn)定，圖像清晰，實(shí)現(xiàn)連續(xù)長時間監(jiān)測，成功率高。本實(shí)驗(yàn)觀察了25只雄性SD大鼠，其中成功監(jiān)測18只，成功率約為72%。與改進(jìn)前成功率相比，實(shí)驗(yàn)效率大幅度提高。成功連續(xù)監(jiān)測3 d的18只大鼠，在6h的監(jiān)測期間均能正常入睡，平均體重（392±38）g。其中 Wake期占（25.32±9.06）%，NREM期占（69.29±13.15）% ，REM期占（5.43±3.11）%。PS次數(shù)在清醒期 5（40，0）次，NREM期 14（54，0）次，REM期 2（19，0）次。SP在期為 2（15，0）次，NREM期為 3（14，0）次，REM期 3（18，0）次（表 1）。

3 討論

本研究通過改進(jìn)自由活動大鼠睡眠呼吸同步監(jiān)測技術(shù)，成功記錄了18只SD大鼠的數(shù)據(jù)，信號穩(wěn)定，圖像清晰，成功率高。

我們主要從監(jiān)測電極、信號接入線路及動物手術(shù)三方面改進(jìn)了大鼠睡眠呼吸監(jiān)測技術(shù)。改進(jìn)前，監(jiān)測電極需要由8孔電極板人工焊制，元件質(zhì)量不穩(wěn)定，且需要熟練的技術(shù)人員操作。改進(jìn)后，由消毒不銹鋼螺絲作為ECoG電極，接觸面積更大，固定更加牢靠，且腦電信號穩(wěn)定，圖像清晰。改進(jìn)前，信號接入線路由5根？0.25 mm漆包線擰成一股組成，存在制作耗時且導(dǎo)線較細(xì)容易纏繞打結(jié)易斷、傳導(dǎo)信號不穩(wěn)定及壽命短的缺點(diǎn)。改進(jìn)后使用6根直徑1mm鍍銀耐高溫線，克服了以上不足，且可以重復(fù)使用，節(jié)約成本和時間。改進(jìn)后的方法操作簡單，信號穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)耐用，可用于大、小鼠等動物的睡眠呼吸監(jiān)測。

Tab.1 Respiration data in different sleep／wake states of rats（ˉx±s，n＝18）

在實(shí)驗(yàn)操作過程中，需注意以下幾點(diǎn)，以確保實(shí)驗(yàn)效果。

（1）動物手術(shù)過程中，腦立體定位儀的使用正確與否直接關(guān)系到電極放置位置及其他解剖定位如第四腦室置管的成敗。所以必須要正確使用腦立體定位儀。

（2）安放ECoG電極的時，旋進(jìn)顱內(nèi)螺紋的長度約為螺帽下整個螺紋長度的1／3左右，動作要緩慢輕柔。此外，用牙托水泥將6孔插件固定在大鼠頭部正中位置，避免被大鼠前肢抓掉。

（3）監(jiān)測要在大鼠術(shù)后恢復(fù)7～10 d后方可進(jìn)行，避免手術(shù)部位滲血，減少動物痛苦，避免監(jiān)測信號的基線漂移。

（4）給動物戴“監(jiān)測帽子”（即插頭和插座連接）時，動作要輕柔迅速，并且提前撫摸毛發(fā)等方式安撫動物，避免動物受驚。

（5）使用微壓傳感器記錄大鼠呼吸時，調(diào)整使流入、流出氣流平穩(wěn)。另外監(jiān)測所在房間門也要盡量減少開閉次數(shù)，微小氣壓變化也會影響呼吸波形。另外，在監(jiān)測中，要保持環(huán)境安靜。

（6）動物的個體差異很大，需根據(jù)每個監(jiān)測圖實(shí)際情況進(jìn)行分析，且所有的監(jiān)測數(shù)據(jù)分析均由同一個人反復(fù)進(jìn)行。

［1］ 王 菁，王廣發(fā)，凌亦凌.自由活動大鼠睡眠狀態(tài)和呼吸節(jié)律的同步監(jiān)測方法［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20（3）：310-312.

［2］ 王 菁，王廣發(fā)，凌亦凌.成年Sprague-Dawley大鼠的睡眠結(jié)構(gòu)和呼吸暫停分析［J］.中國病理生理雜志，2005，21（3）：621-624.

［3］ Chu QP，Wang LE，Cui XY，et al.Extract of Ganoderma lucidum potentiates pentobarbital-induced sleep via a GABAergic mechanism［J］.Pharmacol Biochem Behav，2007，86（4）：693-698.

［4］ Nakamura A，Kuwaki T.Sleep apnea in mice：a useful animal model for study of SIDS［J］.Early Hum Dev，2003，75（Suppl）：S167-174.