黃林靜，何金波，王淑君，馬迎春，應(yīng) 磊，汪 洋，王萬(wàn)鐵△

本室先前研究發(fā)現(xiàn)［1］，低氧高二氧化碳性肺血管收縮（hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV）過(guò)程是呈雙向收縮反應(yīng)（I期快速收縮、快速舒張；II期持續(xù)收縮），但單用鉀通道機(jī)制和鈣通道機(jī)制似乎不能解釋該雙向收縮過(guò)程。近年來(lái)研究報(bào)道［2，3］，存在于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的氯通道與細(xì)胞容量的調(diào)節(jié)、肌電活動(dòng)及肌張力有關(guān)，氯離子通道的激活可以引起肺動(dòng)脈平滑肌的收縮，但其參與Ⅰ期收縮還是Ⅱ期收縮亦或共同作用引發(fā)肺血管張力增高，至今尚未明了。本實(shí)驗(yàn)采用氯離子通道阻斷劑--尼氟滅酸（niflumic acid，NFA）在急性低氧高二氧化碳條件下分別處理離體大鼠二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，動(dòng)態(tài)觀察其血管張力的變化，探討氯離子通道在HHPV發(fā)生發(fā)展中的作用。從而為臨床HHPV的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

離體組織灌流浴槽、張力換能器（西班牙 Panlab公司）；Power lab八道生理記錄儀（澳大利亞 Ad instruments公司）；血?dú)夥治鰞x（日本希森美康醫(yī)用電子上海有限公司；AVL COMPACT3型）；自動(dòng)電子天平（GB303 type，METTLER TOLEDOGroup，Shang hai）；恒溫震蕩水浴儀（DSHZ-300，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；78-2型磁力攪拌器（江蘇中大儀器廠）；Mettler Toledo 413型 PH計(jì) SWITZERLAND；直型顯微鑷（18cm北京北方三友醫(yī)療器械有限公司）；眼科顯微剪（北京中興名業(yè)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品和試劑

二甲基亞砜（DMSO）（上海申工生物技術(shù)有限公司）；重酒石酸去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品）；乙酰膽堿（acetycholine，Ach）（美國(guó) Sigma公司）；NFA（美國(guó) Sigma公司）；NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，Glucose，EDTA均為市場(chǎng)所售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán) 頸椎脫臼法處死大鼠后，開(kāi)胸取出心肺，置于4℃Krebs液中迅速剪開(kāi)右心室，剪除左右肺葉并洗凈殘血。然后快速、輕柔分離肺右側(cè)二級(jí)、三級(jí)肺動(dòng)脈（right main branch pulmonary artery）（注意不要過(guò)度牽拉血管和接觸血管腔面以免損傷血管內(nèi)皮），制成3 mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)。動(dòng)脈環(huán)穿過(guò)兩個(gè)直徑0.2 mm的三角形不銹鋼小鉤后，置于盛有10 ml Krebs液的恒溫（37℃）離體血管灌注浴槽內(nèi)，下端固定于槽底部，上端通過(guò)張力換能器與Power lab八道生理記錄儀相連，記錄肺動(dòng)脈環(huán)張力的變化。

1.3.2 平衡血管、檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)制備的二級(jí)肺動(dòng)脈的最適前負(fù)荷為750 mg，三級(jí)肺動(dòng)脈的最適前負(fù)荷為450 mg，調(diào)節(jié)張力微調(diào)器使最適前負(fù)荷在60 min內(nèi)加至血管并維持平衡60 min，其間持續(xù)通入 95%O2＋5%CO2混合氣體。達(dá)到平衡后的肺動(dòng)脈環(huán)用NE（10-5mol／L）預(yù)收縮后觀察 Ach（10-5mol／L）的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，若出現(xiàn)85%以上的舒張反應(yīng)（舒張張力占同組NE收縮張力的百分?jǐn)?shù)）視為內(nèi)皮細(xì)胞完整，否則棄之不用。最后，沖洗血管環(huán)平衡30 min，記錄平衡張力值P0。1.3.3 血管環(huán)常氧反應(yīng)性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)向浴槽內(nèi)通入95%O2＋5%CO2混合氣體，每隔5 min記錄平均張力值 （P）1次，并計(jì)算張力變化率 P（%）＝（P-P0）／P0×100%。

1.3.4 血管環(huán)低氧高二氧化碳反應(yīng)性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前用92%N2＋8%CO2的混合氣體充灌 pH 7.35的灌流液（37℃）約 40 min，將溶液瓶密閉，用血?dú)夥治鰞x監(jiān)測(cè)灌流液的PO2及PCO2使其分別在30 mmHg（4.00 kPa）和 60 mmHg（8.00 kPa）的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將以上液體灌流入組織浴槽中形成急性低氧高二氧化碳模型。繼續(xù)向浴槽液體中通入上述無(wú)氧氣體并觀察60 min，注意浴槽加蓋，使浴槽中的灌流液 PO2＝30～35 mmHg［（4.00～4.67）kPa］，而 PCO2則在55～60mmHg［（7.33～8.00）kPa］的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)期間每隔5 min記錄平均張力值1次，并計(jì)算低氧高二氧化碳所致的張力變化率。

1.3.5 肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)低氧高二氧化碳的反應(yīng)性及尼氟滅酸干預(yù) 二、三級(jí)動(dòng)脈環(huán)分別隨機(jī)分為：常氧組（N組）；低氧高二氧化碳組 （H組）；DMSO組 （HD組）；尼氟滅酸組（NFA組，）。在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，用氯離子通道阻斷劑NFA孵育肺二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，觀察藥物對(duì)低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈收縮的影響，以明確其在HHPV中的作用，DMSO組為藥物對(duì)照組，藥物在配置中是以DMSO作為有機(jī)溶劑，對(duì)以上各組除N組外，均按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性測(cè)定的方法測(cè)定肺動(dòng)脈血管環(huán)張力變化，HD組和NFA組分別是用DMSO（0.05%）和NFA（10-5mol／L），孵育20 min后按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性的測(cè)定方法測(cè)定血管張力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（張力變化率）以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用單因素方差分析，對(duì)每個(gè)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)上每個(gè)分組之間的作用做兩兩比較。方差齊性者采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行DunnetsT3法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 低氧高二氧化碳對(duì)二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的直接影響

N組持續(xù)通入 95%O2＋5%CO2混合氣體 60 min，張力變化率（PN%）無(wú)明顯變化。H組持續(xù)通入92%N2＋8%CO2混合氣體 60 min，PH%呈倒拋物線樣變化；即在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，二、三級(jí)肺動(dòng)脈呈現(xiàn)出雙向性收縮變化（biphasic pulmonary artery vasoconstriction）（圖 1、圖 2）。其中 I期快速收縮峰最大 PH%為（36.86±12.94）%、I期舒張最大PH%為、（-1.78±8.44）%、II期持續(xù)收縮為最大PH%為（47.87±4.85）%。H組與N組相比，急性低氧高二氧化碳引起的二、三級(jí)肺動(dòng)脈雙向收縮變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，表 1、表 2）。

Fig.1 Dynamic graph of the second pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition

Fig.2 Dynamic graph of the third pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition

2.2 尼氟滅酸在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中對(duì)二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的直接影響

急性低氧高二氧化碳條件下，用尼氟滅酸孵育二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)后，I期快速收縮峰無(wú)明顯變化，但I(xiàn)I期的持續(xù)收縮顯著減弱，與HD組相比，II期的收縮幅度明顯下降（P＜0.05，P＜0.01，圖 3、圖 4，表 1、表 2）。

Fig.3 Dynamic graph of the second pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition in the niflumic acid（NFA）group

Fig.4 Dynamic graph of the third pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition in the niflumic acid（NFA）group

Tab.1 The second pulmonary artery rings’tension change rate under the four conditions（%，ˉx±s，n＝8）

Tab.2 The third pulmonary artery rings’tension change rate under the four conditions（%，ˉx±s，n＝8）

3 討論

氯離子是體內(nèi)最為豐富的陰離子，參與細(xì)胞體積調(diào)節(jié)、靜息膜電位和興奮性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期的調(diào)控等各種生理過(guò)程。研究表明［4，5］生物膜上存在多種類型氯離子通道，主要有（1）背景氯離子通道，此通道在靜息膜電位具有顯著的開(kāi)放頻率；（2）雙筒氯離子通道，該通道具有特殊的門(mén)控機(jī)制；（3）最大氯離子通道，它具有相當(dāng)高的電導(dǎo)；（4）鈣激活性氯離子通道（Clca），為許多因子所激活。但在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上研究較多的是Clca、容量激活性氯離子通道（C1swell）。細(xì)胞膜氯離子的靜息通透性相對(duì)較大，血管平滑肌細(xì)胞氯離子平衡電位（約-34 mv）比靜息膜電位（約-55 mv）高，故鈣激活性氯離子通道有較強(qiáng)的去極化作用，在調(diào)控血管張力和收縮性方面起著重要作用［6］。楊朝等發(fā)現(xiàn)［7］Clca在生理狀態(tài)下參與了苯福林（phenylephrine，PE）引起的肺動(dòng)脈收縮。據(jù)此推測(cè)：低氧高二氧化碳（可直接使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜通透性增加）時(shí)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流增大；同時(shí)各種體液因子引起平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平持續(xù)升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，鈣激活性氯離子通道開(kāi)放，使氯離子外流，后者減少了細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的負(fù)電荷，從而維持去極化狀態(tài)，鈣離子進(jìn)一步內(nèi)流，活化Ca2＋-Ca M系統(tǒng)，激活平滑肌細(xì)胞的收縮蛋白，最終引發(fā)HHPV。尼氟滅酸是氯離子通道阻斷劑，可顯著抑制 Clca，還可完全阻斷 C1swell［8］。因此，尼氟滅酸對(duì)低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓可能具有一定的緩解作用。

本室先前研究發(fā)現(xiàn)，常氧狀態(tài)下NFA對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力無(wú)明顯影響。其原因是常氧狀態(tài)下，［Ca2＋］i為 50～100 nmol，而激活 Clca的［Ca2＋］i是185 nmol／L，故Clca未開(kāi)放。本研究結(jié)果顯示：離體二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)分別暴露于低氧高二氧化碳環(huán)境下1 h內(nèi)發(fā)生了雙相性收縮反應(yīng)，這與Sylvester等［9］的研究結(jié)果一致。雙相收縮通常包含兩個(gè)部分：初始的快速而短暫的收縮（I期收縮）和隨后的緩慢而持續(xù)的收縮（II期收縮期）。用NFA分別預(yù)處理二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)后，暴露于低氧高二氧化碳環(huán)境中1 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其II期收縮幅度明顯減少，最大張力變化率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；然而，NFA對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)的I期收縮程度卻沒(méi)有明顯的降低作用。說(shuō)明在肺動(dòng)脈環(huán)的II期收縮過(guò)程中，Clca的激活發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，NFA對(duì)低氧高二氧化碳環(huán)境中肺動(dòng)脈環(huán)的I期收縮雖無(wú)明顯影響，但在一定程度上增強(qiáng)了 I期舒張。以往研究發(fā)現(xiàn)［10］，［Ca2＋］i升高先于低氧誘導(dǎo)的膜去極化，從咖啡因敏感型鈣庫(kù)釋放Ca2＋是低氧高二氧化碳性肺血管收縮的早期事件。因此，低氧早期誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣引起［Ca2＋］i升高僅一過(guò)性的快速升高，從而引起肺動(dòng)脈短暫而快速的收縮，但卻不足以激活Clca。由此可見(jiàn)，NFA對(duì)HHPV中的I期收縮無(wú)顯著影響。另外，此時(shí)可能只是鈣庫(kù)釋放鈣引起的短暫收縮，沒(méi)有發(fā)生膜去極化，電壓門(mén)控性鈣離子通道沒(méi)有被激活或細(xì)胞膜離子通道的鈣內(nèi)流不足以補(bǔ)充低氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的耗竭，隨著細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)鈣離子的耗竭，興奮-收縮偶聯(lián)興奮性隨之減弱，從而發(fā)生隨之的快速舒張作用（I期舒張）。另外，我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)藥物組與HD組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DMSO對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)無(wú)影響，可以作為我們所用藥物的溶劑。

綜上所述，在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，二、三級(jí)肺動(dòng)脈呈現(xiàn)出雙向性收縮變化（I期快速收縮、快速舒張；II期持續(xù)收縮），氯離子通道阻斷劑—尼氟滅酸可減輕大鼠二、三級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)的張力變化率（尤其是II期的持續(xù)性收縮），從而發(fā)揮拮抗HHPV的作用。

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