郝卯林，趙 珊，陳海娥，陳 丹，宋 冬，何金波，汪 洋，王萬鐵

目前隨著心胸外科手術(shù)的廣泛開展，肺缺血／再灌注損傷（pulmonary ischemia-reperfusion injury，PIRI）的問題日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，肺組織細(xì)胞凋亡在PIRI發(fā)生中起關(guān)鍵作用，且干預(yù)細(xì)胞凋亡對(duì)再灌注肺損傷有一定的防治作用［1］。但目前尚不清楚在肺缺血再灌注過程中，這些損傷因素是通過何種方式引起組織細(xì)胞凋亡。

隨著對(duì)疾病發(fā)生的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制認(rèn)識(shí)的迅速提高，有關(guān)器官缺血／再灌注（ischemia reperfusion，I／R）后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的變化日益受到關(guān)注，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在臟器I／R中起重要作用。缺血缺氧、葡萄糖／營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、氧化應(yīng)激及Ca2＋穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起ERS，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）上調(diào)是其敏感標(biāo)志物，適度的ERS對(duì)機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用，積極重建細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但持續(xù)過強(qiáng)的 ERS將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至死亡［2］。JNK信號(hào)通路是 ERS的凋亡途徑之一，JNK通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中重要的通路之一，存在于多種生命過程中，參與細(xì)胞生長、分化和死亡，且JNK通路易受多種細(xì)胞外應(yīng)激因素激活并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。有研究表明，在臟器 I／R損傷過程中存在有JNK的過度激活，而在缺血前或再灌注前抑制JNK的激活，可明顯減少細(xì)胞凋亡從而減輕I／R后的組織損傷［4，5］。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種技術(shù)，可特異性地阻斷特定基因，從而達(dá)到靶向干預(yù)的效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNAi技術(shù)，化學(xué)合成3條JNK-siRNA，干擾小鼠在體PIRI模型使JNK基因沉默，以對(duì)過度ERS下JNK通路對(duì)小鼠肺細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行研究，探討再灌注肺組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并篩選出有效的JNK-siRNA，以期為臨床治療PIRI提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性 C57BL／6小鼠70只，平均體重（20±2）g。由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2010-0150）。

1.2 試劑

In Situ Cell Death Detection Kit，POD（Roche），siRNA試劑（invitrogen），Lipofectamine.2000TM Reagent（invitrogen），Trizol Reagent（ambion／RNA，Life technologies），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas Life Science），PCR試劑盒（Fermentas Life Science）；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（中國杭州賢至生物科技有限公司），GRP78一抗、JNK一抗、磷酸化 JNK（p-JNK）一抗（Cell Signaling Technology），二抗（辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所），DAB顯色試劑盒（×20）（北京中杉金橋生物科技有限公司），DeoxyribonucleaseⅠ（Sigma），其余均為市售分析純。

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)合成 從Genbank數(shù)據(jù)庫檢索基因來源為小鼠JNK基因序列，geneID：26419。使用Ambion公司的siRNA的設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)小鼠體內(nèi)JNK基因序列，設(shè)計(jì) siRNA，用以沉默JNK序列，觀察JNK的凋亡作用。雖然可以通過對(duì)mRNA實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但這個(gè)過程十分耗時(shí)且昂貴。因此我們設(shè)計(jì)三對(duì)與JNK基因序列不同位點(diǎn)結(jié)合的siRNA使得沉默效果更好。其中三對(duì)siRNA及一對(duì)陰性對(duì)照序列如表1所示。體外化學(xué)合成siRNA，進(jìn)行硫代修飾，應(yīng)用Lipofectamine2000TM載體運(yùn)載 siRNA，通過鼻飼法［6］干擾在體I／R模型，其中siRNA試劑配置如下：（1）250μl PBS稀釋 150μg siRNA，旋轉(zhuǎn)混勻；（2）200 μl PBS稀釋50μl Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑，旋轉(zhuǎn)混勻；（3）加250μl轉(zhuǎn)染試劑稀釋液至 250μl siRNA溶液中，立即旋轉(zhuǎn)混勻；（4）室溫孵育15 min，穩(wěn)定后即可使用。（5）每只小鼠滴鼻總體積50μL。siRNA給予量保證在15μg。

Tab.1 Sequences for siRNA of JNK and negative control group

1.3 動(dòng)物模型復(fù)制

小鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮（0.1 mg／g）＋塞拉嗪（0.01 mg／g）進(jìn)行麻醉。切開氣管，氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：潮氣量0.6 ml，呼吸頻率 120 counts／min，吸呼比 3∶2。電熱毯保溫，監(jiān)測體溫。沿左胸骨斷開第2、3肋骨，打開胸腔，暴露左肺，找到左肺門并以微型動(dòng)脈夾夾閉30 min，即為缺血期；之后松開動(dòng)脈夾，形成再灌注期，再灌注3 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為7組：Sham組，I／R組，I／R＋PBS＋Lipo組，I／R＋SCR組，I／R＋siRNAJNK1（序列①），I／R＋siRNAJNK2（序列②），I／R＋siRNAJNK3（序列③）（n＝10），于實(shí)驗(yàn)前 2 d通過鼻飼法干擾小鼠，以確保siRNA充分發(fā)揮作用［6］。Sham組只開胸不夾閉肺門，觀察3.5 h后處死并取左肺；I／R組：阻斷左肺門30 min，再灌注3 h，處死取左肺；I／R＋PBS＋Lipo組：給予 PBS溶液和 Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑，余同 I／R組；I／R＋SCR組：給予 PBS溶液、Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑包裹的無關(guān)序列的siRNA，余同 I／R組；I／R＋JNK-siRNA各組：給予 PBS溶液、Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑和 Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑包裹的目的siRNA，余同I／R組。

1.5 肺濕干重比（wet／dry weight ratio，W／D）和總肺含水量（total lung water content，TLW）檢測

取左肺上葉組織，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱重為濕重；在恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱70℃24 h烘干后稱重為干重，兩者之比為肺W／D。TLW的計(jì)算公式如下：TLW ＝（W-D）／D。

1.6 肺組織光鏡檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取左肺下葉約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肺組織，經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組標(biāo)本組織學(xué)改變。在400倍視野下隨機(jī)連續(xù)觀察50個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的總肺泡數(shù)及損傷肺泡數(shù)。肺泡內(nèi)含紅細(xì)胞或白細(xì)胞超過2個(gè)以上或肺泡內(nèi)含有水腫滲出液的均視為損傷肺泡。把損傷肺泡數(shù)占總計(jì)肺泡數(shù)百分比的值作為IQA。

1.7 RT-PCR法檢測JNK、GRP78基因表達(dá)

Trizol法抽提總RNA，測定總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件為：起始變性，95℃，1 min；變性，95℃，30 s；退 火，55℃ （GAPDH）／56℃ （JNK）／49℃（GRP78），30 s；延伸，72℃，30 s；終止延伸，72℃，10 min，循環(huán)數(shù)33次。

Tab.2Sequences for primers

1.8 Western blot法檢測 JNK、p-JNK、GRP78蛋白含量

將約100 mg肺組織塊置研缽中并碾碎，加800 μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）于研缽中，于冰上反復(fù)碾壓使組織碾碎。取上清液，BCA法測定蛋白濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后加入一抗JNK、P-JNK、GRP78單克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（1∶1 000稀釋），4℃反鋪法過夜。分別加入1∶500二抗，室溫反應(yīng)2 h。ECL化學(xué)發(fā)光，X射線底片曝光。其中JNK為p-JNK的內(nèi)參，p-JNK蛋白含量的計(jì)算方法為p-JNK兩條帶總的吸光度值除以JNK兩條帶總的吸光度值。

1.9 原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測肺組織細(xì)胞凋亡

按照試劑盒說明操作。細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）＝檢測到的凋亡細(xì)胞數(shù)÷5個(gè)高倍視野檢測到的細(xì)胞總數(shù)×100%

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用均數(shù)＋標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組肺W／D、TLW和IQA的變化

與 Sham組相比，I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組W／D、TLW和 IQA均明顯升高（P＜0.01），I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組兩兩比較，W／D、TLW和IQA均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組相比，I／R＋JNK-siRNA各組W／D、TLW和 IQA均降低，其中以 I／R＋siRNAJNK1組降低最為明顯（P＜0.05，P＜0.01，表 3）。

Tab.3 W／D，TLW，IQA and AI of lung tissue in different groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 各組肺組織形態(tài)學(xué)改變

Sham組肺間質(zhì)及肺泡完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤（圖 1A）。I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁水腫增厚或破裂，肺泡內(nèi)水腫滲出或紅細(xì)胞漏出或炎性細(xì)胞漏出（圖1B、1C、1D，細(xì)箭頭示肺泡炎性浸潤，粗箭頭示肺間質(zhì)增厚）。I／R＋JNK-siRNA各組肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整，肺泡內(nèi)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤不同程度減輕，以I／R＋siRNAJNK1組減輕最為明顯（圖 1E、1F、1G）。

Fig.1 Light morphological changes in lung tissue of mice in various groups（HE×200）A：Sham group；B：I／Rgroup；C：I／R＋PBS＋Lipo group；D：I／R＋siRNASCRgroup；E：I／R＋siRNA JNK 1 group；F：I／R＋siRNA JNK 2 group；G：I／R＋siRNA JNK 3 group；I／R：Ischemia／reperfusion；JNK：C-Jun-N-terminal kinase

2.3 各組肺組織細(xì)胞AI的改變

Sham組細(xì)胞凋亡數(shù)量較少，與Sham組相比，I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞凋亡以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞為主，AI亦均明顯升高（P＜0.01）；I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和I／R＋SCR組兩兩比較，AI均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與 I／R＋PBS＋Lipo組和I／R＋SCR組相比，JNK-siRNA各組細(xì)胞凋亡減少，AI均降低，其中以I／R＋siRNAJNK1組降低最為明顯（P＜0.05，P＜0.01，圖 2，表 3）。

Fig.2 Apoptosis in lung tissue of mice in various groups detected by TUNEL method（POD，×400）A：Sham group；B：I／R group；C：I／R＋PBSgroup；D：I／R＋PBS＋Lipo group；E：I／R＋siRNASCR group；F：I／R＋siRNA JNK 1 group；G：I／R＋siRNA JNK 2 group；H：I／R＋siRNA JNK 3 group；I／R：Ischemia／reperfusion；JNK：C-Jun-N-terminal kinase

2.4 各組JNK和GRP78基因水平表達(dá)的變化

與Sham組相比，GRP78 mRNA在其余所有組別中均明顯表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。JNK mRNA在I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組中明顯表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），而在 I／R＋JNK-siRNA各組中則表達(dá)量較 I／R組下降（P＜0.05，P＜0.01），其中以I／R＋siRNAJNK1組JNK mRNA表達(dá)量下降最為明顯（P＜0.01，圖 3，表 4）。

2.5 各組JNK、p-JNK和GRP78蛋白水平表達(dá)的變化

與Sham組相比，GRP78蛋白在其余所有組別中均明顯表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。各組肺組織均可檢測到JNK的表達(dá)，且表達(dá)量在各組間無明顯差異。與 Sham組相比，p-JNK蛋白在 I／R組、I／R＋PBS＋Lipo組和 I／R＋SCR組中明顯表達(dá)（P＜0.01），而在 I／R＋JNK-siRNA各組中則表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），其中以 I／R＋siRNAJNK1組 p-JNK蛋白表達(dá)量下降最為明顯（P＜0.01，圖 4，表 5）。

Fig.3 Expression levels of JNK and GRP78 mRNA in lung tissue of mice in various groups detected by RT-PCRA：Sham group；B：I／R group；C：I／R＋PBS＋Lipo group；D：I／R＋siRNASCR group；E：I／R＋siRNAJNK 1 group；F：I／R＋siRNAJNK 2 group；G：I／R＋siRNAJNK 3 group

Tab.4 Relative content of JNK and GRP78 mRNA of lung tissue in different groups（ˉx±s，n＝10）

Fig.4 Expression levels of p-JNK and GRP78 proteins in lung tissue of mice in various groups detected by Western blotA：Sham group；B：I／R group；C：I／R＋PBS＋Lipo group；D：I／R＋siRNA SCR group；E：I／R＋siRNA JNK 1 group；F：I／R＋siRNA JNK 2 group；G：I／R＋siRNA JNK 3 group

Tab.5 Content of GRP78 and p-JNK proteins in different groups（ˉx±s，n＝10）

3 討論

PIRI常見于肺移植術(shù)、肺栓塞溶栓治療等，是臨床上肺移植手術(shù)的一大難題，嚴(yán)重影響肺部手術(shù)患者的愈后恢復(fù)。因此，探尋PIRI的發(fā)生機(jī)制和臨床有效可行的防治方法至關(guān)重要。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，器官I／R時(shí)誘發(fā)了細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡又加重了I／R的組織損傷；器官I／R時(shí)誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑很多，其中最主要的兩條是MAPKs信號(hào)通路和ERS信號(hào)通路［1］。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用小鼠單肺左側(cè)原位I／R模型觀察PIRI的改變。研究結(jié)果顯示：與Sham組相比，I／R組與溶劑對(duì)照組和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組肺組織W／D、TLW值顯著升高；光鏡下，與Sham組相比，I／R組及溶劑對(duì)照組肺泡間隔增寬水腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肺泡內(nèi)有血液成分滲出。同時(shí)TUNEL法檢測結(jié)果顯示再灌注后即出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡。提示細(xì)胞凋亡參與了肺I／R損傷的發(fā)生。經(jīng)JNK-siRNA干預(yù)后，肺組織細(xì)胞凋亡減少，W／D、TLW和IQA降低，肺組織結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。表明通過抑制JNK通路可減輕肺細(xì)胞凋亡，這與本實(shí)驗(yàn)室先前研究結(jié)論一致［5］。

ERS可被多種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的刺激因素引起，如臟器 I／R時(shí)發(fā)生的缺血缺氧等［7］。但當(dāng) ERS持續(xù)過強(qiáng)時(shí)將啟動(dòng)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑引起組織損傷。正常情況下，GRP78與ER腔內(nèi)側(cè)的三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、Ire1（inositol-requiring protein-1，Ire1）和ATF6（activating transcription factor 6，ATF6）結(jié)合而處于無活性狀態(tài)。ERS發(fā)生時(shí)，GRP78即與這3種蛋白質(zhì)解離而與未折疊／錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)結(jié)合以協(xié)助其正確折疊，因此GRP78表達(dá)的急速上調(diào)也被認(rèn)為是ERS最敏感的標(biāo)志［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GRP78的基因和蛋白表達(dá)量在Sham組中很低，而肺I／R后表達(dá)明顯上調(diào)。說明肺I／R成功誘導(dǎo)了過度ERS發(fā)生。

過度ERS發(fā)生時(shí)，保護(hù)機(jī)制不能與損傷抗衡，GRP78表達(dá)不再增加并與Ire1解離，活化的Ire1進(jìn)而與 TRAFα（TNF receptor-associated factorα，TRAFα）和 ASK1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）相連接，其復(fù)合物將激活JNK通路，引起細(xì)胞凋亡［8］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧和心肌I／R中，心肌組織細(xì)胞再灌注損傷與GRP78、JNK表達(dá)增高有關(guān)［9］。本研究結(jié)果顯示，肺再灌注后JNK基因和p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與細(xì)胞凋亡變化趨勢和病理損傷程度相一致，由此提示再灌注可激活JNK，且JNK引起肺細(xì)胞凋亡。

RNA干擾技術(shù)是一種新的阻抑基因表達(dá)的方法，它是一種序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，通過人工導(dǎo)入的一段與目的基因同源的雙鏈RNA序列使其mRNA降解，表達(dá)缺失，實(shí)現(xiàn)基因沉默［10］?，F(xiàn)今，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)開發(fā)新型的靶向藥物己成為藥物研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，體外化學(xué)合成三條JNK-siRNA，通過滴鼻法干擾實(shí)驗(yàn)小鼠［6］，沉默JNK基因以對(duì)抗PIRI。本實(shí)驗(yàn)觀察到，應(yīng)用JNK-siRNA沉默JNK基因后，JNK mRNA和p-JNK蛋白表達(dá)量均減少，肺組織損傷程度和細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯減輕。而且各項(xiàng)指標(biāo)均表明以I／R＋siRNAJNK1組保護(hù)作用最明顯，這說明在我們設(shè)計(jì)出的三條siRNA序列中，以序列①沉默JNK mRNA效果最好，這為以后進(jìn)行的JNK mRNA沉默的研究提供了有力的證據(jù)并減少了實(shí)驗(yàn)資源的浪費(fèi)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PIRI引起肺組織細(xì)胞發(fā)生過度的ERS，并通過JNK通路引起細(xì)胞凋亡，損傷肺組織；應(yīng)用siRNA沉默JNK mRNA能減輕PIRI引起的細(xì)胞凋亡和組織損傷。

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