林中民，焦立卓，鄭 怡，王曉雅，王 玲，劉網(wǎng)網(wǎng)，徐夢(mèng)菲，姬秀煥，陳三妹，陳國(guó)榮Δ

糖尿病心肌病變是在糖脂代謝紊亂基礎(chǔ)上合并發(fā)生的心肌慢性病變。已有研究表明心肌能量代謝的變化、心肌纖維化和脂質(zhì)過氧化作用參與糖尿病心肌病變的發(fā)展［1，2］，而姜黃素已被證實(shí)具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等［3］廣泛的藥理活性，但其是否具有抗糖尿病心肌病變的作用鮮有報(bào)道。本研究通過光鏡和透射電鏡觀察姜黃素衍生物B06對(duì)高脂飲食及2型糖尿病大鼠心肌的病理變化，并測(cè)定心肌腺苷酸活化蛋白激酶 ɑ（AMP-activated proteinkinaseɑ，AMPKɑ）和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 ɑ（phosphorylated AMP-activated protein kinaseɑ，p-AMPKɑ）的蛋白表達(dá)水平，探討B(tài)06對(duì)2型糖尿病心肌病變的防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

雄性SD大鼠35只（溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重 160～200 g，隨機(jī)均分為 5組（n＝7）：正常對(duì)照組（NC組）、高脂組（HF組）、高脂治療組（FT組）、糖尿病組（DM組）和糖尿病治療組（DT組），NC組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，后四組以高脂飼料喂養(yǎng)［4］（飼料組成：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料）。高脂喂養(yǎng)4周后，DM組及DT組在禁食12 h后按30 mg／kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，溶于 0.1 mmol／L枸櫞酸緩沖液內(nèi)，配成濃度為 6 mg／ml的溶液，pH 4.0），72 h后尾靜脈測(cè)血糖，血糖＞16.7 mmol／L為造模成功，NC組、HF組及FT組腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。成模后，后四組均繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，F(xiàn)T組和 DT組按 0.2 mg／kg·d的劑量灌胃 B06（溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院梁廣教授惠贈(zèng)，B06溶于1%羧甲基纖維素鈉），其余組灌胃等量的1%羧甲基纖維素鈉，每天一次，并且每天稱體重一次，持續(xù)8周。

1.2 血生化指標(biāo)和血胰島素水平的檢測(cè)

禁食12 h后，股動(dòng)脈放血處死大鼠，收集血清，用微量血糖儀測(cè)定血糖，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂，雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定血胰島素水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Insulin resistance index，IRI＝血糖×血胰島素／22.5）。ELISA試劑盒購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司。

1.3 光鏡標(biāo)本制備

取左室心肌，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水并石蠟包埋，制成3μm厚的切片，心肌 Masson染色，光鏡下觀察心肌膠原纖維分布。

1.4 透射電鏡標(biāo)本制備

取左室心肌，大小1 mm×1 mm×1 mm，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸潤(rùn)包埋，半薄切片定位，超薄切片，H-7500型透射電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.5 Western blot法檢測(cè)心肌組織 AMPKɑ和 p-AMPKɑ的蛋白表達(dá)水平

取100 mg心肌組織常規(guī)提取心室肌組織蛋白，以BCA試劑盒做蛋白定量。蛋白樣品行電泳，轉(zhuǎn)膜，抗AMPKɑ和抗p-AMPKɑ一抗室溫孵育，TBST溶液洗滌后HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影定影，掃描后用GelPro32圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描分析。以目的蛋白條帶與β-Actin條帶累積光密度（IOD）之比作為反映蛋白表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。抗 AMPKɑ和抗 p-AMPKɑ一抗購(gòu)于美國(guó) Cell Signaling Technology，二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 17.0軟件分析，兩組比較用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組體重比較

12周末，HF組體重顯著高于NC組（P＜0.01），DM組體重顯著低于 HF組（P＜0.01），F(xiàn)T組和 DT組體重分別與HF組和DM組比較無顯著差異（表1）。

Tab.1 Comparison of body weight among five groups after 12 weeks（ˉx±s，n＝7）

2.2 B06對(duì)血糖、血胰島素、IRI及血脂水平的影響

HF組血糖、血胰島素、胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IRI）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）及低密度脂蛋白／高密度脂蛋白（low density lipoprotein／high density lipoprotein，LDL／HDL）顯著高于 NC組（P＜0.05，P＜0.01），經(jīng)B06治療后，F(xiàn)T組血糖、血胰島素、IRI及 TG較 HF組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），TC、LDL／HDL無顯著差異；DM組血糖、IRI、TG、TC及 LDL／HDL顯著高于HF組（P＜0.01），經(jīng) B06治療后，DT組血糖、血胰島素、IRI、TG、TC及 LDL／HDL較 DM組顯著下降（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Effect of B06 on serum glucose，blood insulin，IRI and serum lipid levels（ˉx±s，n＝7）

2.3 光鏡觀察

心肌Masson染色顯示，NC組大鼠心外膜、血管壁周圍見少量淺綠色的纖維成分（圖1A），其余部位未見膠原纖維存在；HF組（圖1B）和FT組（圖1C）血管壁周圍見少量綠色的膠原纖維，心肌細(xì)胞間未見明顯膠原纖維形成，與NC組無明顯差異；DM組見大量綠色的膠原纖維存在，廣泛分布于心肌細(xì)胞間（圖1D），相互連接纏繞成纖維化區(qū)域，血管壁周圍也可見膠原纖維增生；DT組心肌細(xì)胞間纖維化區(qū)域明顯減少，少量散在分布（圖1E，圖1見彩圖頁Ⅱ）。

Fig. 1 Light micrography of myocardium in rats（Masson Staining ×200）A：A little collagenous fiber distributed around the blood vessel from NC group；B：A small amount of collagenous fiber arranged with the blood vessel from HF group；C：A small quantity of collagenous fiber existed surrounding the blood vessel from FT group；D：Proliferation of collagenous fiber in the interstitium of myocardium from DM group；E：Fibrosis ameliorated in the interstitium of myocardium from DT group

2.4 透射電鏡觀察

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示，NC組心肌細(xì)胞線粒體豐富，粗細(xì)肌絲排列整齊，閏盤部位明顯；HF組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體略腫脹，線粒體嵴紊亂，粗細(xì)肌絲間隙增寬，排列尚整齊（圖2A），F(xiàn)T組與NC組心肌細(xì)胞電鏡下觀察基本一致（圖2B）；DM組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹明顯，線粒體嵴紊亂、部分消失，粗細(xì)肌絲間隙增寬，排列紊亂，部分肌絲扭曲變形，甚至溶解，閏盤消失（圖2C），另見部分區(qū)分布大量膠原纖維，提示心肌細(xì)胞纖維化存在（圖2D）；DT組心肌細(xì)胞見線粒體腫脹減輕，粗細(xì)肌絲排列略有變形，閏盤較明顯，未見明顯膠原纖維（圖2E）。

2.5 B06對(duì)心肌組織AMPKɑ和p-AMPKɑ蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果分析顯示，HF組心肌組織AMPKɑ、p-AMPKɑ表達(dá)較 NC組明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），經(jīng) B06治療后，F(xiàn)T組與 HF組相比，心肌組織 p-AMPKɑ表達(dá)顯著升高（P＜0.01），AMPKɑ表達(dá)無差異；DM組心肌組織p-AMPKɑ表達(dá)較HF組顯著下降（P＜0.01），AMPKɑ呈下降趨勢(shì)，無顯著差異，經(jīng)B06治療后，DT組與DM組相比，心肌組織AMPKɑ、p-AMPKɑ表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01，圖 3、表 3）。

Fig.2 Transmission electron microscopy of myocardium in rats A：Expansion of myocardium mitochondria from HF group（×10k）；B：Plenty of myocardium mitochondria and aligned myofilament from FT group（×10k）；C：Expansion of myocardium mitochondria，disarrangement of cristae，widened and distorted myofilament clearance from DM group（×20k）；D：Plenty of disarrangement of collagen fiber from DM group（×10k）；E：Expansion of myocardium mitochondria lightened，slightly distorted myofilament from DT group（×20k）

Fig.3 Effect of B06 on cardiac AMPKɑand p-AMPKɑprotein expression1，2：FT group；3，4：HF group；5：NC group；6，7：DM group；8，9：DT group

Tab.3 Effect of B06 on cardiac AMPKɑand p-AMPKɑprotein expression

3 討論

胰島素抵抗介導(dǎo)的心肌代謝紊亂是導(dǎo)致糖尿病心肌病發(fā)生的主要機(jī)制之一，不同的因素，包括心肌胰島素抵抗、葡萄糖攝取降低和脂肪酸氧化利用障礙，都可能參與糖尿病心肌病的發(fā)生。研究證實(shí)，高糖、高胰島素均能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白合成及其基因的表達(dá)，其機(jī)制與促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）基因表達(dá)增加密切相關(guān)［5］。膠原生成增加和降解減少將導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化，使心肌順應(yīng)性下降，并出現(xiàn)泵功能障礙。因此，胰島素敏感性和糖脂代謝的正常化已經(jīng)被認(rèn)為能夠減緩糖尿病心肌并發(fā)癥的發(fā)生。而能量代謝是維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和功能正常的重要支柱。作為“能量代謝調(diào)節(jié)器”，AMPKɑ1分布廣泛，AMPKɑ2主要分布于心肌、骨骼肌和肝臟，AMPK能對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)AMP／ATP比例的變化迅速產(chǎn)生反應(yīng)，而糖尿病時(shí)心肌AMPK活性下降。在缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饑餓等情況下，細(xì)胞內(nèi)AMP／ATP比例增加，繼而AMPKɑ亞基的蘇氨酸172位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾后激活而具有生物活性。p-AMPK可磷酸化下游的信號(hào)分子發(fā)揮能量代謝的調(diào)控作用，可通過胰島素非依賴機(jī)制促進(jìn)心肌葡萄糖攝取，可能與誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位及其基因的表達(dá)增加相關(guān)［6］。另外，AMPK可直接磷酸化激活糖酵解的限速酶磷酸果糖激酶2，產(chǎn)生2，6-二磷酸果糖，從而促進(jìn)糖酵解。同時(shí)還能減少糖異生酶的表達(dá)，抑制糖異生［7］。而高脂血癥在胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生中起重要作用，羥甲基戊二酸CoA還原酶和乙酰CoA羧化酶（ACC）分別是膽固醇和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，且均為AMPK的重要底物。p-AMPK使兩者磷酸化失活，而分別抑制膽固醇和脂肪酸合成。同時(shí)，ACC是丙二酰CoA合成的限速酶，而后者又可變構(gòu)抑制肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶I，進(jìn)而促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂酰CoA轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體進(jìn)行脂肪酸有氧氧化［8］。因此，激活的 AMPK可通過增加GLUT4的轉(zhuǎn)位、增強(qiáng)脂肪酸的氧化利用和降低脂質(zhì)聚集，從而改善心肌胰島素敏感性。Viollet等［9］研究同樣表明，AMPKɑ2基因剔除與葡萄糖耐受不良和胰島素分泌降低相關(guān)，并可誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，而AMPK特異性激活劑具有胰島素增敏效應(yīng)。以往的研究表明，高糖高脂可引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡，影響心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和功能正常。本研究結(jié)果顯示，HF組出現(xiàn)高糖高脂，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)紊亂并伴有心肌AMPKɑ和p-AMPKɑ的表達(dá)下降；而糖尿病本身就存在糖脂代謝紊亂，本研究中DM組血糖血脂均較HF組升高，胰島素抵抗明顯，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)紊亂，纖維化增多并伴有心肌 p-AMPKɑ的表達(dá)顯著下降，表明糖尿病可引起嚴(yán)重的心肌損傷，這與我們以往的研究［10］中證實(shí)的糖尿病導(dǎo)致心肌損傷的結(jié)論一致，而本研究表明心肌AMPK活性的下降將導(dǎo)致心肌糖脂代謝障礙和胰島素敏感性下降。國(guó)內(nèi)外眾多研究指出，姜黃素能夠改善糖尿病狀態(tài)下的高血糖，其機(jī)制可能與降膽固醇、抗氧化特性和自由基清除能力有關(guān)［3］；另外，姜黃素可能通過影響脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化相關(guān)酶和蛋白的表達(dá)而發(fā)揮降血脂的作用［11］。Kim等［12］研究表明，姜黃素可通過增加肝細(xì)胞的p-AMPK活性，而抑制肝糖異生起到降血糖的效應(yīng)。而姜黃素衍生物B06是一種單羰基姜黃素類似物，其性質(zhì)更穩(wěn)定，生物利用度更高。我們的研究顯示，F(xiàn)T組和DT組心肌AMPKɑ及 p-AMPKɑ的表達(dá)分別較HF組和DM組明顯升高，表明姜黃素衍生物B06可增加心肌AMPK的活性，并改善心肌糖脂代謝及胰島素抵抗，同時(shí)減輕DT組的心肌間質(zhì)纖維化。

綜上所述，增強(qiáng)AMPK活性目前已成為治療2型糖尿病的一個(gè)新策略。但是，在心肌病變中被激活的AMPK，主要延緩不良后果的開始和發(fā)展，不足以完全防止不良后果［13］。基于此，一種潛在的治療方法是藥理性的AMPK激活來加強(qiáng)或延長(zhǎng)心肌保護(hù)作用。B06對(duì)糖尿病心肌有一定的保護(hù)作用，可改善糖脂代謝、胰島素敏感性并減輕心肌纖維化，可能與增強(qiáng)心肌AMPKɑ及p-AMPKɑ活性有關(guān)，但其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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