袁文肅，許麗娟，劉夢丹，王悅冰，李 董

胃漿膜下肌層主要包含外層縱形?。╨ongitudinal muscle，LM）和中層環(huán)形?。╟ircular muscle，CM），胃痙攣是由兩種胃壁平滑肌異常收縮引起胃運動功能失調(diào)。神經(jīng)激素控制胃壁平滑肌的收縮，其中非腎上腺能非膽堿能（non-adrenergic non-cholinergic，NANC）神經(jīng)廣泛分布在胃腸道，在胃腸道平滑肌運動的調(diào)節(jié)中起著重要作用［1］。核苷類物質(zhì)中 ATP是消化道神經(jīng)系統(tǒng)的NANC神經(jīng)遞質(zhì)，對胃腸道動力和分泌功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前研究中，核苷類藥物以其特異性干擾核酸的代謝、阻止細胞的分裂和繁殖的作用，被廣泛應用到抗腫瘤、抗艾滋病等藥物研發(fā)中，但是對其副作用尤其是針對胃反應的副作用，還有待深入研究。

近來報道，細胞外核苷例如ATP和UTP，可以引起胃平滑肌的收縮。另一種細胞外核苷四磷酸脲腺苷 （dinucleotide uridine adenosine tetraphosphate，Up4A），是一種新被認定為可以誘導血管平滑肌收縮的內(nèi)皮衍生的收縮因子，而Up4A是否能引起胃平滑肌的收縮尚不清楚。

已知ATP和UTP可以作用于P2X和P2Y受體，激活信號通路，引發(fā)不同的反應，其中就包括平滑肌收縮反應。另外，環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛也能抑制離體腸平滑肌的收縮。與此同時，有報道稱Up4A，可以在大鼠肺動脈平滑?。?］和主動脈平滑肌中［3］引起收縮。但胃平滑肌中對這幾種藥物的反應機制還有待進一步研究，為此，我們比較了胃縱行肌和環(huán)形肌分別對上述三種藥物的反應。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

雄性 Wistar大鼠（6～8周齡，250～300 g）購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。ATP和UTP購自Thermo Scientific公司。Up4A購自 BioLog公司，Nimodipine，indomethacin，α，β-me-ATP，suramin，IP5I and Y-27632均購自Sigma公司。

1.2 組織分離與收縮測定

胃縱行平滑肌和胃環(huán)行平滑肌從雄性Wistar大鼠體內(nèi)取得。實驗前大鼠禁食24 h，處死后迅速剖開腹腔，取得全胃。沿胃小彎剪開，暴露黏膜，用Krebs-Henseleit緩沖液漂洗，Krebs-Henseleit緩沖液的成分（mmol／L為：NaCl（118），KCl（4.7），CaCl2（2.5），MgCl2（1.2），NaHCO3（25），KH2PO4（1.2）and D-glucose（10），pH 7.2。緩沖液在 37°C，95%O2和5%CO2環(huán)境下平衡。用顯微剪分別沿縱行肌和環(huán)行肌纖維的方向切取肌肉。分別將LM和CM切為3 x 10 mm的條形肌肉。將肌肉一端用絲線固定在支架上，放入內(nèi)置Krebs-Henseleit緩沖液的塑料肌肉槽中，另一端用絲線與張力換能器相連。設置起始靜息張力為20 mN，平衡1 h。在所有組織中均加入50 mmol／L KCl引起收縮，其余藥物的收縮以 50 mmol／L KCl收縮的百分比表示（%KCl）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ˉx±s）的形式表示。各組數(shù)據(jù)采用Student T-Test進行統(tǒng)計學處理，組間用ANOVA分析。

2 結果

2.1 ATP，UTP和Up4A對LM和CM收縮的影響

不同濃度的ATP，UTP和Up4A，分別作用于LM和CM，均能引起LM和CM的收縮，反應呈濃度依賴性增強。可以看出，同等濃度下，ATP在LM中引起的收縮小于CM（圖1A），UTP在LM中引起的收縮同樣小于 CM（圖1 B），而 Up4A在大于 10μmol／L濃度的情況下。在LM中引起的收縮大于CM（圖1 C）。

2.2 IP5I在LM和CM中對Up4A引起的收縮變化

為了采用非選擇性P2X受體抑制劑IP5I檢測P2X受體是否參與在胃平滑肌收縮中的作用，。在基礎張力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收縮，之后將Up4A用Krebs-Henseleit緩沖液洗掉，平衡 30 min后，加入 20μmol／L P2X IP5I，并孵育 30 min，加入 5μmol／L Up4A（圖 2 A、圖 2 B）。LM的Up4A收縮大?。?4.26±4.65）%，CM的 Up4A收縮為（69.57±6.60）%，經(jīng)過 IP5I孵育后，LM的Up4A收縮大?。?0.94±7.89）%，CM的 Up4A收縮為（63.72±4.45）%，其收縮并未出現(xiàn)明顯抑制（圖 2 C）。

Fig.1 Contractile responses induced by ATP，UTP and Up4A in rat gastric LM and CM preparations In tissue bioassay，rat gastric LM and CM tissues were treated with A：ATP；B：UTP；C：Up4A at the concentrations indicated.The y-axis in C represents contractile responses standardized using the KCl（50 mmol／L）responses in the same tissues.Each data point represents theˉx±s（ATP，n＝8；UTP，n＝8；Up4A，n＝5）

2.3 Suramin在CM中對Up4A引起的收縮變化

采用非選擇性P2Y受體抑制劑suramin檢測P2Y受體是否參與在胃平滑肌收縮中的作用。在基礎張力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收縮，之后將Up4A用Krebs-Henseleit緩沖液洗掉，平衡30 min后，加入10μmol／L P2Y受體抑制劑Suramin，并孵育 30 min，加入 5μmol／L Up4A（圖 3 A、圖3 B）。LM的 Up4A收縮大?。?5.57±7.43）%，CM的 Up4A收縮為（52.95±10.43）%，經(jīng)過 suramin孵育后，LM的 Up4A收縮大?。?9.78±8.06）%，CM的Up4A收縮為（4.52±1.66）%。LM中，suramin并不能抑制Up4A引起的收縮，而在CM中，suramin能顯著抑制Up4A引起的收縮（圖3 C）。

Fig.2 IP5I does not attenuate Up4A-induced contractions in LM and CM preparations（ˉx±s，n＝7）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate

Fig.3 Suramin inhibits Up4A-induced contractions in CM，but not LM preparations（ˉx±s，n＝9）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate*P＜0.05 vs LM

2.4 吲哚美辛在CM中對Up4A引起的收縮變化

采用環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛檢測環(huán)氧合酶是否參與在胃平滑肌收縮中的作用。在基礎張力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收縮，之后將Up4A用Krebs-Henseleit緩沖液洗掉，平衡30 min后，加入 100 nmol／L吲哚美辛，并孵育30 min，加入 5μmol／L Up4A（圖 4 A、圖4 B）。LM的 Up4A收縮大?。?7.35±5.92）%，CM的 Up4A收縮為（50.55±3.89）%，經(jīng)過吲哚美辛孵育后，LM的Up4A收縮大?。?0.35±9.33）%，CM的 Up4A收縮為（11.16±3.55）%。LM中，吲哚美辛并不能抑制Up4A引起的收縮，而在CM中，吲哚美辛能顯著抑制Up4A引起的收縮（圖4 C）。

Fig.4 Indomethacin inhibits Up4A-induced contractions in CM preparation（ˉx±s，n＝6）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate*P＜0.05 vs LM

3 討論

細胞外核苷是NANC神經(jīng)介導消化道反應的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，在1970年，Burnstock和他的同事們首次提出ATP為NANC神經(jīng)遞質(zhì)。最近Jankowski等人發(fā)現(xiàn)尿四磷酸脲腺苷是一種潛在的誘導血管平滑肌收縮的內(nèi)皮衍生的收縮因子［4］。許多研究者報道了體內(nèi)或體外實驗均證實了Up4A可以在非疾病動物模型中調(diào)節(jié)血管收縮活性。由于Up4A兼具嘌呤和嘧啶特性，這些研究主要著眼于Up4A與嘌呤受體之間的關系。

根據(jù)藥理學性質(zhì)分類，嘌呤受體包括兩種亞型：P1受體（或稱腺苷受體）和 P2受體［5-7］。腺苷受體及磷酸化腺苷受體，ATP和ADP，分別是P1和P2受體的內(nèi)源性配體。P1受體包括四個亞型：分別命名為A1，A2A，A2B和 A3。P2受體包括兩個主要家族：P2X受體和 P2Y受體［8，9］。

本實驗中 ATP，UTP在 100 nmol／L～100μmol／L濃度范圍內(nèi)引起大鼠胃縱行肌與環(huán)形肌的收縮反應，且隨濃度增高，收縮反應呈濃度依賴性增強。在超過 100μmol／L濃度后，藥物反應趨于飽和。而Up4A在在 100 nmol／L～10μmol／L濃度范圍內(nèi)能引起大鼠胃縱行肌和環(huán)形肌濃度依賴性收縮，在超過10μmol／L濃度后，藥物反應趨于飽和。

Gui等人研究了Up4A在大鼠肺動脈中的作用和信號機制［2］。Up4A在離體大鼠肺動脈中，可以引發(fā)濃度依賴性的收縮。Up4A誘導的大鼠肺動脈收縮可被suramin所抑制，但不能被P2X受體拮抗劑IP5I或用α，β-methylene-ATP對 P2X受體脫敏的方法所抑制。在本實驗中，LM和CM中加入P2X受體的非選擇性抑制劑IP5I，均不能明顯抑制Up4A引發(fā)的收縮。提示在LM和CM中，P2X受體可能并未參與Up4A引發(fā)的收縮，同時也驗證了Gui等人的實驗結果。

Suramin是一種P2X和P2Y嘌呤受體的非特異性拮抗劑［10］。某些P2Y受體對suramin的抑制作用比其它受體更為敏感。先前的研究表明，200μmol／L的suramin可以顯著降低ATP對大鼠胃基底環(huán)行平滑肌的舒張，并抑制ATP對LM的收縮［6］。我們的結果顯示，非選擇性P2Y受體拮抗劑suramin可以顯著抑制Up4A在CM中的收縮，但不能抑制在LM中的收縮，這表明，很可能有兩種不同的P2Y受體亞型參與Up4A對平滑肌的收縮作用。這些受體亞型在CM中對suramin的抑制更為敏感。使用非選擇性環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（100 nmol／L），可以抑制Up4A所引起的對CM的收縮，但對LM無影響，這顯示環(huán)氧合酶可能參與胃環(huán)形平滑肌的收縮。

我們的研究證實了兩種不同的平滑肌對胞外核苷的收縮反應不同，提高細胞外核苷水平和／或降低細胞外核苷的釋放與活性能夠作為減輕胃腸動力障礙的藥物靶點。為今后設計安全有效的新型胞外核苷類藥物，減少此類藥物對胃的刺激提供了數(shù)據(jù)。

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