盧彥珍,王 佳,張翠英,宋 娟,李寶紅,宋曉亮
(1.長治醫(yī)學院病理生理學教研室,2.免疫學教研室,3.生理學教研室,4.藥理學教研室,山西 長治046000)
心肌間質構成了心肌細胞生活的微環(huán)境,對心肌細胞不僅具有結構上的支持及保護作用,還具有細胞間信息傳送、協(xié)調舒縮功能等作用。缺血/再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)過程中心肌間質的損傷是導致心臟形態(tài)改變和功能障礙的重要因素[1]。近十幾年來,隨著“重編程”非心肌細胞使其成為心肌細胞,以及間質內Telocytes(TCs)網絡的發(fā)現(xiàn)使人們認識到,研究心臟間質的結構和功能具有重要的理論和實踐意義。缺血后處理(ischemic postconditioning,IPTC)是一種在組織缺血后持續(xù)再灌注前多次短暫再灌注/缺血處理,可以減輕再灌注損傷的內源性保護現(xiàn)象,具有縮小心肌梗死面積、改善心肌功能等與缺血預處理(ischemic preconditioning,IPC)相似的心臟保護作用[2],且由于可控性好,操作簡便,可以方便地應用于臨床,成為當前研究熱點之一[3]。我們前期的研究顯示[4],IPTC通過抑制基質金屬蛋白酶抑制劑-2(matris metalloproteinases-2,MMP-2)的活性和表達對心肌間質有保護,但具體機制不詳。金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是基質金屬蛋白酶 MMPs生理性抑制物,活性的 MMPs受特定的 TIMPs調節(jié),那么TIMPs是否參與IPTC對心肌間質的保護作用?本研究通過觀察MMP-2及其抑制物TIMP-2表達,探討IPTC對I/R心肌間質損傷的保護機制,為IPTC抗心肌I/R損傷治療提供新思路。
1.1.1 主要試劑 MMP-2及TIMP-2多克隆抗體購自Santa Cruz公司;β-actin單克隆抗體和堿性磷酸酶標記的IgG二抗購自Sigma公司;RT-PCR檢測試劑盒購自Takara公司;CK、LDH試劑盒購自長城公司。1.1.2 動物模型的建立和分組 取健康雄性SD大鼠24只,體重(250±30)g,采用 20%的烏拉坦 1 g/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板,連接小動物呼吸機,在左側第三、四肋間切開皮膚,鈍性分離肌層,打開胸腔,充分暴露心臟,在左心耳與肺動脈圓錐之間于左心耳下約2 mm處穿線后隨機分為3組(n=8):(1)假手術對照(SC)組,穿線后曠置60 min;(2)I/R組,結扎左冠狀動脈前降支20 min,解除結扎灌注 40 min;(3)IPTC組,按 Zhao[5]等的方法在缺血后立即給予再灌注30 s、缺血30 s,連續(xù)3個循環(huán),復制缺血后處理動物模型。復制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ導聯(lián)變化和結扎區(qū)心臟表面顏色的變化來判斷,結扎左冠狀動脈前降支后心電圖ST段抬高,結扎相應部位心臟表面肉眼觀變暗變紫說明缺血成功,解除結扎后ST段下降1/2以上標志再灌注成功。
1.2.1 左室功能測定 從右頸總動脈插入 PE-50軟質塑料導管至左心室,應用生理記錄儀記錄左心室壓力曲線,生理記錄儀自動計算出左室內壓上升及下降最大速率(±m(xù)aximal rise velocity of left ventricular pressure,±dp/dt max)。記錄各組缺血前和再灌注40 min左心室峰壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、±dp/dt max及Ⅱ導心電圖。
1.2.2 心肌羥脯氨酸含量測定 按文獻方法[6],稱取凍存左室心肌約100 mg,置于丙酮-乙醚混合液脫水、脫脂兩次,取出晾干,105℃烤箱內干燥至恒重,精確稱取干燥心臟樣品10 mg,加入6 mol/L HCl 3 ml,105℃烘箱烤16 h。冷卻后調 pH為6,加去離子水至 10 ml,以 3 000 r/min離心 10 min,取 2 ml上清液與標準管和空白管一起測A值,計算出羥脯氨酸含量后換算成心肌膠原含量。
1.2.3 血清磷酸肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性的檢測 再灌注結束后,從大鼠頸動脈取血液2 ml,常溫靜置20 min后放入低溫離心機,3 000 r/min離心5 min,分離血清后按照試劑盒說明進行操作,計算出血清磷酸肌酸激酶(creatinekinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogerase,LDH)的活性。
1.2.4 Western blot檢測心肌組織中 MMP-2和TIMP-2蛋白表達變化 取液氮凍存心肌60 mg粉碎后加入組織蛋白裂解液,置于勻漿器中勻漿,冰上裂解后離心,取上清得心肌組織提取液。蛋白定量后,以每泳道20μg蛋白上樣,10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,再電轉移至硝酸纖維素膜上。室溫封閉1 h,加 MMP-2和 TIMP-2(1∶1 000稀釋)一抗 4℃孵育過夜,TBST洗滌后,加入1∶5 000堿性磷酸酶標記的IgG二抗,室溫孵育1 h,洗滌后,用化學發(fā)光法檢測目的蛋白的表達水平。為校正上樣誤差,將每張膜上的目的蛋白洗脫后,按照上述步驟檢測β-actin的表達水平。
1.2.5 RT-PCR技術檢測心肌組織中 MMP-2和TIMP-2 mRNA的相對表達量 取儲存于液氮中的心肌組織按照Trizol一步法提取心肌組織總RNA,經1%的瓊脂糖電泳證實RNA的完整性后,用紫外分光光度儀進行總RNA定量和純度檢測,參照逆轉錄試劑盒(Takara公司)說明書行半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應。反應體系為:12.5μl SYBER Green,10 μmol/L上下游引物混合物 0.5μl,模板 1μl,加水補足25μl。反應條件為:95℃預變性5 min后進入PCR循環(huán):95℃變性5 min,58℃退火 30 s,延伸 1 min,共32個循環(huán)。MMP-2、TIMP-2引物參照基因庫基因序列設計,MMP-2上游引物5′-ACGATGGCAAGGTGTGGTGT-3′,下 游 引 物 5′-CCTTGGTCAGGACAGAAGCC-3′;TIMP-2上游引物 5′-ATTTATCTACACGGCCCC-3′,下游引物 5′-CAAGAACCATCACTTCTCT TG-3′。目的基因擴增過程中采用β-actin作為內參基因,根據2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。
I/R組 LVSP、±dp/dt max均顯著降低,與 SC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。反應心臟功能的三項重要指標明顯降低,表明I/R時心功能嚴重受損;而IPTC可使三項指標明顯改善(P<0.05,P<0.01,表 1)。
Tab.1 Effect of IPTC on cardiac function in rat subjected to ischemia/reperfusion((kPa/s,,n=8)
Tab.1 Effect of IPTC on cardiac function in rat subjected to ischemia/reperfusion((kPa/s,,n=8)
SC:Sham control;I/R:Ischemic/reperfusion;IPTC:Ischemic postconditioning;LVSP:Left ventricular systolic pressure;dp/dt max:Maximal rise velocity of left ventricular pressure;-dp/dt max:Maximal fall velocity of left ventricular pressure**P<0.01 vs SC;#P<0.05,##P<0.01 vs I/R group
Group LVSP(kPa)dp/dt max -dp/dt max SC 13.37±2.16 783.13±54.72 564.41±37.33 I/R 6.83±1.75**424.23±35.26**325.25±48.24**IPTC 12.23±1.83## 647.51±48.95## 42143±45.81#
I/R組大鼠心肌膠原含量明顯減少,血清CK、LDH活性增高,與 SC組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。經過IPTC后大鼠心肌膠原含量明顯升高,血清 CK、LDH活性明顯降低(P<0.01,表 2)。
Tab.2 Changes of myocardial collagen content and the activitis of CK and LDH in serum among three group(,n=8)
Tab.2 Changes of myocardial collagen content and the activitis of CK and LDH in serum among three group(,n=8)
SC:Sham control;I/R:Ischemic/reperfusion;IPTC:Ischemic postconditioning;CK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase**P<0.01 vs SCgroup;#P<0.05 vs I/R group
HydroxyprolineCKLDH
SC組心肌組織中MMP-2和TIMP-2蛋白有不同程度的表達,I/R組MMP-2的表達水平明顯高于SC組,而 TIMP-2表達水平明顯降低(P<0.01),有顯著統(tǒng)計學差異。與I/R組相比,IPTC組MMP-2的表達水平顯著降低,而TIMP-2表達水平明顯升高(P<0.05,P<0.01,圖 1)。
與SC組相比,I/R組心肌MMP-2 mRNA水平明顯升高(P<0.01),而 TIMP-2 mRNA水平顯著降低(P<0.01);大鼠經 IPTC后,MMP-2 mRNA水平降低(P<0.01),而 TIMP-2 mRNA水平升高(P<0.05,圖 2)。
Fig.1 Protein expression levels of MMP-2 and TIMP-2 SC:Sham control;I/R:Ischemic/reperfusion;IPTC:Ischemic postconditioning;MMP-2:Matris metalloproteinases-2; TIMP-2: Tissue inhibitor of metalloproteinase-2
Fig.2 mRNA level of MMP-2 and TIMP-2 in rat hearts with ischemia/reperfusion
心肌I/R損傷一直是阻礙缺血心肌從介入性治療和溶栓等再灌注療法中獲得最佳療效的醫(yī)學難題。理論研究和臨床實踐都證實,I/R不但損傷心肌本身,還損傷了心肌間質。我們的實驗結果與此相一致,I/R組不僅有廣泛用于反映心肌損傷程度的“金指標”-血漿CK、LDH活性的增高,而且有反映間質損傷的心肌膠原含量明顯減少,與SC組比較差異有顯著性(P<0.01),提示 I/R使心肌間質嚴重受損。MMPs是唯一能降解心肌間質膠原的一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白水解酶,在23種已知的人類MMPs中,MMP-2在幾乎所有細胞中均有廣泛表達,并且是心肌組織中表達最豐富的MMPs之一。國內外大量臨床、基礎研究結果表明MMP-2的激活、表達活性增強與心肌 I/R損傷有著密切的關系[7]。Jacob-Ferreira等[8]發(fā)現(xiàn)再灌注后的大鼠心臟MMP-2酶活性增強,其蛋白表達升高,并伴有心功能的惡化。Cheung等[9]在大鼠離體心臟模型上研究發(fā)現(xiàn),再灌注早期冠脈流出液中MMP-2增加,并隨著時間的延長而不斷增加,且與再灌注后心肌機械運動能力的減弱成正比。在灌流液中加入純化的MMP-2,可使I/R后心功能惡化,而用含MMP-2抗體的灌流液灌注,可對 I/R心肌起保護作用。李科等[10]通過對冠心病患者I/R治療后血清MMP-2及-9水平變化的研究,認為血清MMP-2及-9表達水平增高可能是心肌I/R損傷的機制之一,有可能成為經皮冠狀動脈介入術后評價心肌I/R損傷嚴重程度的較好預測因子。
我們的實驗結果與上述文獻報道以及之前實驗研究結果一致[4],I/R組心肌 MMP-2活性和 MMP-2的表達均明顯升高,同時,心肌膠原含量明顯減少,反應心功能參數(shù)的LVSP、±dp/dt max明顯低于SC組(P<0.01),表明MMP-2的釋放和活性的增加與心肌間質的破壞和心功能損害有明顯的相關性。因此抑制心肌中MMPs的表達和活性是治療心肌再灌注損傷的一個有效靶點。活化的MMPs能被其抑制物TIMPs所抑制[11]。但是外源性 TIMPs受各種因素影響容易發(fā)生變性和降解,細胞因子可誘導TIMP合成,但副作用較大,使用受到限制。因此調動內源性保護機制使局部天然TIMP過表達來中和MMPs將是治療I/R損傷的希望。在生理狀態(tài)下,TIMPs與MMPs之間保持著一種動態(tài)平衡,使有活性的MMPs控制在一定范圍內,協(xié)調ECM降解與重建,維持間質結構的完整和穩(wěn)定。目前發(fā)現(xiàn)TIMP家族成員有 TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3,TIMP-4四種,不同的TIMPs對MMPs家族中的不同成員作用有一定的特異性,如:TIMP-1幾乎抑制所有的 MMP,尤其是MMP-9的活性;TIMP-2是一種相對分子量為21×103的非糖基化蛋白質,與明膠酶A前體有最大親和力,主要抑制MMP-2的活性。TIMPs主要從兩個方面抑制MMP的活性,在酶原階段可以與MMP形成穩(wěn)定的復合物從而妨礙MMP酶原的自我激活,在活化階段以1∶1組成復合物,阻斷其與底物的結合,從而抑制其功能,是組織局部MMPs活性最重要的調節(jié)因素,這表明維持正常的TIMPs濃度和MMPs/TIMPs比例對保護I/R心肌間質的損傷十分重要。
IPTC的概念是相對于缺血預處理而提出的,由于是在缺血后實施,與缺血預處理相比易于實施,可控性好,操作方便,而且心肌保護效果可與缺血預處理相媲美[2]。內源性保護機制IPTC理論的提出,無疑是再灌注治療研究領域的一個重大突破,但目前的研究基本上集中在對心肌細胞的保護上。我們前期的研究顯示,IPTC可通過抑制MMP-2的活性和表達對間質起到保護作用[4]。本實驗在此基礎上研究TIMPs是否參與IPTC對心肌間質的保護作用,結果表明,缺血/再灌注后,大鼠心肌在MMP-2蛋白表達明顯上調的同時TIMP-2蛋白表達明顯下調,與SC組相比有顯著差異。TIMP-2蛋白表達水平及mRNA表達水平的下調增強了MMP-2的活性,增加其對膠原的降解,使心肌膠原含量減少(P<0.01),間質破壞,與Chulze等[12]研究發(fā)現(xiàn)的再灌注過程中MMPs/TIMPs比值的改變能促進心肌I/R的發(fā)生的結論一致。缺血畢立刻給予再灌注30 s、缺血30 s,連續(xù)3個循環(huán),即進行內源性保護機制缺血后處理干預,大鼠心肌TIMP-2活性和TIMP-2的表達均明顯上調,MMP-2蛋白表達及mRNA表達水平下調,心肌膠原含量增加,心功能明顯的改善,提示TIMP-2參與了IPTC對心肌間質的保護作用。IPTC是通過何種機制上調 TIMP-2活性和 TIMP-2的表達,進而抑制MMP-2的過度表達,恢復MMPs/TIMPs比值,減輕心肌I/R心肌間質損傷的機制不明。結合文獻我們推測:可能機制與IPTC可以通過抗氧化應激作用抑制再灌注過程中氧自由基和某些炎癥細胞因子的釋放有關。已證實心肌I/R過程中產生的大量氧自由基和細胞因子如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α等可明顯抑制 TIMP-2的表達,誘導大量 MMPs的表達[13]。
總之,本實驗不但進一步證實了IPTC對心肌間質的保護作用是通過抑制MMP-2的活性和表達減少起作用的,并且證實ITPC可上調TIMP-2表達,有效拮抗MMP-2的作用,恢復MMPs/TIMPs比值,減輕對心肌間質膠原的降解,從而起到心肌保護的作用。
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