孟祥艷,于海龍,郭 敏,張文成,徐瑞成
(1.武警后勤學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,天津300309;2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院,天津300162;3.天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室,天津300309)
隨著心肌梗死后溶栓或介人治療、冠狀動脈旁 路、心臟移植術(shù)等醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的臨床發(fā)生率日益增加,并成為心血管病人死亡的首要原因[1],探討I/R損傷的發(fā)生機(jī)理并積極尋求其防治手段成為亟待解決的問題。
間歇低壓低氧(intermittent hypobaric hypoxia,IHH)預(yù)處理即間斷性多次短時間暴露于一定海拔高度的低氧環(huán)境而大部分時間處于常氧水平。研究表明,IHH預(yù)處理能預(yù)防應(yīng)激、缺血/缺氧及缺血再灌注損傷等對心肌造成的損傷,產(chǎn)生與缺血預(yù)處理類似的保護(hù)作用,增強(qiáng)心肌對于缺血、缺氧的耐受性,保護(hù)心臟免受持續(xù)性低氧及缺氧/復(fù)氧的損害[2,3]。盡管IHH預(yù)處理已逐步成為臨床醫(yī)學(xué)、高原醫(yī)學(xué)和航空醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點,然而由于其確切的保護(hù)機(jī)制至今尚未完全闡明,IHH預(yù)處理仍然存在著臨床應(yīng)用的難題。進(jìn)一步揭示IHH抗心肌細(xì)胞缺氧性損傷的分子機(jī)制,對于尋找能模擬IHH保護(hù)效應(yīng)的藥物或其他救治手段具有重要的臨床意義。
ZFP580是本研究室克隆的一種新的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄蛋白,ZFP580廣泛存在于大鼠細(xì)胞內(nèi),并在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量最高[4]。前期實驗研究證明其可能參與維持細(xì)胞的正常功能,對于細(xì)胞的存活、增殖等生理活動具有明顯意義[5,6]。在大鼠心肌I/R損傷過程中,L-精氨酸預(yù)處理可明顯上調(diào)大鼠心肌組織中ZFP580的表達(dá)并發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7]。
本實驗旨在通過大鼠心肌I/R損傷模型探討IHH預(yù)處理對大鼠心肌I/R后改善心肌損傷,減少心肌梗死面積的作用及鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580的作用。
雄性Wistar大鼠32只,初始體重為100~130 g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。大鼠隨機(jī)分為間歇低壓低氧(IHH)預(yù)處理組和常氧對照(Nor)組。IHH組大鼠16只,置于模擬海拔高度為5 000 m的低壓氧艙中(PB=404 mmHg,54 kPa;PO2=84 mmHg,11.3 kPa)每天6 h,持續(xù)42 d。NOR組大鼠16只,于常氧環(huán)境下飼養(yǎng)42 d,各組大鼠飼養(yǎng)42 d后體重增長至 380~410 g。
大鼠H9c2心肌細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。CK-MB含量 ELISA檢測試劑盒(R&D),LDH活力試劑盒(南京建成),胎牛血清(Gibco),高糖 DMEM(Hyclone),模擬缺血的缺氧培養(yǎng)基配方(mmol/L,pH 6.2):1.0 KH2PO4,10.0 NaHCO3,1.2 MgCl2·6H2O,25.0 HEPES,74.0 NaCl,16.0 KCl,1.2 CaCl2,20.0 Na lactate。ZFP580一抗(Abcam),β-actin一抗(Sigma),Annexin V-PE/7-AAD染色試劑(Invetrogen),其余試劑為國產(chǎn)分析純。
用25%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉,氣管切開并插管,連接于小型動物呼吸機(jī),調(diào)節(jié)呼吸頻率為 80~90 beats/min,潮氣量 1 ml/100 g。開胸暴露心臟,用小圓針穿5/0號絲線,在肺動脈圓錐右緣、平左心耳間冠狀靜脈走行處下緣2~3 mm淺層心肌進(jìn)行穿線,在心肌表面沿血管走行方向墊一硬質(zhì)塑膠管(直徑2 mm,長1 cm),連同塑膠管一同結(jié)扎,造成冠狀動脈阻塞。冠狀動脈結(jié)扎30 min后,自線結(jié)處剪斷絲線,恢復(fù)血流,實現(xiàn)冠狀動脈再灌注,建立心肌I/R損傷模型。實驗過程中記錄大鼠肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖,以ST段明顯抬高和/或T波高聳作為冠狀動脈結(jié)扎成功的標(biāo)志,抬高的ST段回落1/2以上標(biāo)志冠狀動脈恢復(fù)血液灌注。
各組大鼠心肌缺血后再灌注2 h,自腹主動脈取血,用枸櫞酸抗凝,3 000 r/min離心 10min后,取上層血清。按照試劑盒說明測定各組動物血清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性及肌酸肌酶同功酶(creatine kinase cardiac isoenzyme,CK-MB)含量。
IHH預(yù)處理組和Nor組另外8只大鼠心肌缺血后再灌注2 h,采用在體心肌組織酞菁藍(lán)-TTC(triphenyltetrazolium chloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色法測定心肌梗死面積。具體方法為:將冠狀動脈在原結(jié)扎點結(jié)扎后,沿右頸總動脈快速注射4%酞菁藍(lán)1 ml,1 min后立即取出心臟,-80℃冰凍10 min。沿心臟長軸方向以1~2 mm間隔切成5片心肌橫斷面切片,將心肌切片放入1%TTC溶液(pH 7.4),37℃孵箱中孵化30 min,數(shù)碼相機(jī)拍照。酞菁藍(lán)是一種藍(lán)色染料,可以將非缺血區(qū)染成藍(lán)色;而TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物,它是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體,能與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng),生成紅色化合物,從而使有活力的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。因此,未被染藍(lán)的危險區(qū)中被染成紅色的區(qū)域為非梗死區(qū),不著色(呈蒼白色)的區(qū)域為梗死區(qū)。上述采集的數(shù)碼圖像,通過Image-ProPlus 6.0軟件分析計算梗死面積與危險區(qū)面積的比值(infarct area/area at risk,IA/AAR)
H9c2心肌細(xì)胞于含有10%胎牛血清的高糖DMEM,37℃恒溫培養(yǎng)箱 (5%CO2)孵箱中培養(yǎng),隔天換液,3 d傳代一次,傳代4~5次后進(jìn)行后續(xù)實驗。各組細(xì)胞在實驗前8~12 h利用無血清DMEM饑餓使細(xì)胞同步化。實驗分為:(1)模擬缺血/再灌注(simulated ischemia/reperfusion,SI/R)組:H9c2心肌細(xì)胞換用缺氧培養(yǎng)基(提前用氮氣飽和30 min)后,置入缺氧裝置后密閉。然后從進(jìn)氣口充入混合氣(95%N2+5%CO2),持續(xù)通氣。持續(xù)缺氧3 h后,將細(xì)胞換用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,實現(xiàn)復(fù)氧;(2)對照(Control)組:細(xì)胞換用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)5 h。
重組表達(dá)ZFP580全長基因的慢病毒載體顆粒(lenti-ZFP580),并設(shè)空載體(lenti-NC)為陰性對照。按照感染復(fù)數(shù)(MOI值)200感染H9c2心肌細(xì)胞。慢病毒載體轉(zhuǎn)入H9c2心肌細(xì)胞72 h后,提取心肌細(xì)胞總蛋白,通過Western blot方法檢測ZFP580表達(dá)情況。慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染實驗在H9c2心肌細(xì)胞SI/R實驗前72 h進(jìn)行。
采用流式細(xì)胞術(shù)以Annexin V-PE/7-AAD染色法檢測H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況。各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后,調(diào)整濃度至1×106cells/ml細(xì)胞懸液,經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后分別用PE標(biāo)記的Annexin V和7-AAD進(jìn)行染色,隨后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計數(shù)及分析。細(xì)胞早期凋亡時,細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)并與Annexin V結(jié)合;細(xì)胞晚期凋亡時,細(xì)胞膜已不完整,7-AAD能夠透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞核染紅。據(jù)此原理,Annexin V與7-AAD染色可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。
提取各組大鼠心肌組織及H9c2心肌細(xì)胞總蛋白,用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,將樣品與SDS凝膠加樣緩沖液混合,煮沸10 min使蛋白變性。取60μg總蛋白上樣,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉后,加入一抗(按1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜,漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋),室溫?fù)u床上孵育2 h,充分漂洗后按ECL發(fā)光試劑盒說明書操作,曝光后x光片用凝膠圖像分析軟件掃描,測定蛋白條帶的灰度值。ZFP580表達(dá)結(jié)果用實測值與內(nèi)參β-actin的比值表示。
各組大鼠心肌I/R損傷后,血清中CK-MB含量及LDH活性均較sham組明顯升高。與Nor組大鼠相比較,IHH預(yù)處理組大鼠心肌I/R損傷后,血清中CK-MB含量及LDH活性升高程度較輕,并低于Nor組大鼠I/R損傷后血清中CK-MB及LDH水平(P<0.05,表 1)。
Tab.1 Comparison of LDH activity and CK-MB concentration in the plasma of each group,n=8)
Tab.1 Comparison of LDH activity and CK-MB concentration in the plasma of each group,n=8)
I/R:Ischemia/reperfusion;Nor:Normoxia group;IHH:Intermittent hypobaric hypoxia;LDH:Lactate dehydrogenase;CKMB:Creatine kinase cardiac isoenzyme*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R in Nor
Group LDH(U/L) CK-MB(U/L)Sham in Nor 223.7±14.6 108.8±7.8 I/R in Nor 312.5±16.8* 194.6±10.3*Sham in IHH 245.2±8.7 126.6±11.2 I/R in IHH 287.3±14.5# 162.4±9.6#
經(jīng)酞菁藍(lán)-TTC在體染色后,在大鼠心肌組織橫截面能清晰區(qū)分出白色梗死區(qū),紅色缺血區(qū)及藍(lán)色非缺血區(qū)。經(jīng)IHH預(yù)處理大鼠在心肌I/R損傷后,大鼠心肌梗死面積占左室缺血區(qū)面積的比值(%)為(13.94±2.01)%,較 NOR組(30.57±5.11)%明顯縮小(P<0.05,圖 1)。
Fig.1 Size comparison of I/R induced myocardial infarct between rats in normoxia and IHH preconditioning groups(n=8)A:Rat heart slices stained with 10%TTC;B:Infarction percentage of the area at risk;Nor:Normoxia;IHH:Intermittent hypobaric hypoxia;I/R:Ischemia/reperfusion
各組大鼠心肌組織中ZFP580蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,Nor組及IHH預(yù)處理組大鼠在心肌I/R損傷后,心肌組織中ZFP580蛋白表達(dá)水平均較相應(yīng)sham組下調(diào)(0.76±0.08-fold vs 1,1.36±0.12-fold vs 1.68±0.2-fold)。然而,經(jīng) IHH預(yù)處理的大鼠心肌I/R損傷后,心肌組織中ZFP580蛋白表達(dá)水平明顯高于 NOR組(1.36±0.12-fold vs 0.76±0.08-fold,P<0.05,圖2)。對 H9c2心肌細(xì)胞中 ZFP580表達(dá)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染病毒載體Lenti-ZFP580后H9c2心肌細(xì)胞中 ZFP580表達(dá)明顯上調(diào)(1.98±0.26-fold vs 1,P<0.05,圖 3A)
Fig.2 Levels of ZFP580 protein in myocardium of rats with or without I/R in normoxia and IHA hypoxia groups(n=8)Nor:Normoxia group;IHH:Intermittent hypobaric hypoxia;I/R:Ischemia/reperfusion
各組心肌細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)染72 h后進(jìn)行SI/R損傷實驗,經(jīng)流式細(xì)胞儀均可檢測到凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染病毒載體Lenti-ZFP580后高表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在 SI/R損傷后細(xì)胞凋亡率為(11.9±2.3)%,明顯低于轉(zhuǎn)染空載體Lenti-NC的陰性對照組(21.07±1.5)%(P<0.05,圖 3B)。
早在上世紀(jì)50年代末,人們第一次發(fā)現(xiàn)生活在高海拔地區(qū)的人群心肌梗死的發(fā)生率明顯低于生活在平原的人群[8]。隨后,有關(guān)缺氧具有心肌保護(hù)作用的研究在動物實驗水平逐漸開展,人們利用低壓低氧艙模擬高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境進(jìn)行了大量的研究,并最終證實了IHH的心肌保護(hù)作用,驗證了這一流行病學(xué)觀察結(jié)果[9]。然而,對于IHH是如何發(fā)揮心肌保護(hù)作用的,仍是困擾人們的一大難題。本實驗按照文獻(xiàn)報道的方法[10]模擬低壓低氧環(huán)境,大鼠在此環(huán)境適應(yīng)42 d后進(jìn)行心肌I/R損傷實驗,實驗中發(fā)現(xiàn)IHH預(yù)處理大鼠心肌對于I/R損傷的耐受性明顯增強(qiáng),表現(xiàn)在心肌I/R損傷后心肌梗死面積縮小以及血清中心肌酶的漏出減少。實驗證明本實驗采用的IHH預(yù)處理對于大鼠心肌I/R損傷具有明顯心肌保護(hù)作用,然而其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步的實驗論證。
Fig.3 SI/R-induced apoptosis assay determined by annexin V/7-AAD staining and flow cytometry analysis
本組在先前的工作中獲得了一個人類心血管疾病相關(guān)新基因ZNF580(Genbank注冊號:AF184939),并隨后獲得了鼠源性同源基因ZFP580。在前期對于ZFP580/ZNF580基因功能研究的實驗中發(fā)現(xiàn),其編碼一種具有調(diào)控作用的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子,對維持細(xì)胞的存活、增殖等生理活動具有明顯意義。本實驗中發(fā)現(xiàn),經(jīng)IHH預(yù)處理后大鼠心肌組織中ZFP580的表達(dá)明顯上調(diào),IHH預(yù)處理明顯抑制心肌I/R損傷導(dǎo)致的心肌組織中ZFP580表達(dá)的下降。由此,我們設(shè)想ZFP580是否參與了IHH低氧預(yù)處理抗心肌I/R損傷的過程,并發(fā)揮一定的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。凋亡和壞死是缺血心肌再灌注后導(dǎo)致細(xì)胞死亡的兩種方式,有研究認(rèn)為心肌缺血導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式以壞死為主,而再灌注后導(dǎo)致的細(xì)胞死亡形式則多為凋亡,細(xì)胞凋亡是心肌I/R后引發(fā)心肌細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)[11]。也有研究表明細(xì)胞凋亡是影響病人預(yù)后的主要因素,而減少或抑制I/R后心肌細(xì)胞凋亡能明顯減少心肌梗死面積,提高心肌收縮功能,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]。為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子ZFP580在I/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。本研究通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染實驗觀察了ZFP580不同表達(dá)水平的心肌細(xì)胞在SI/R損傷后細(xì)胞凋亡的情況。實驗發(fā)現(xiàn),ZFP580高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在SI/R損傷后細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組細(xì)胞。據(jù)此我們推斷,ZFP580可能作為細(xì)胞內(nèi)源性抗凋亡機(jī)制之一在心肌I/R后發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。
總之,本實驗通過大鼠心肌I/R損傷模型,證實了IHH預(yù)處理對于I/R所致心肌損傷的保護(hù)作用,并觀察到鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580在IHH預(yù)處理大鼠心肌中表達(dá)上調(diào);通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染實驗獲得高表達(dá)ZFP580的心肌細(xì)胞,并證實心肌細(xì)胞高表達(dá)ZFP580后對于SI/R損傷具有更強(qiáng)的耐受性,明顯降低了細(xì)胞的凋亡率。由此可見,ZFP580可能作為心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗凋亡機(jī)制之一,參與IHH預(yù)處理對抗心肌I/R損傷的過程,然而ZFP580參與抗凋亡的具體機(jī)制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍值得我們進(jìn)一步研究。
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