王小琴，彭聿平，劉 展，邱一華

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，江蘇南通226001）

兒茶酚胺包括腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺，主要由神經(jīng)細胞及內(nèi)分泌細胞合成釋放，除了可以調(diào)節(jié)機體的心血管、呼吸和消化功能外，還可以調(diào)節(jié)機體的免疫功能。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是兒茶酚胺合成的限速酶。本實驗室以往的研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞可以表達 TH，并且能夠合成釋放兒茶酚胺。此外，T淋巴細胞來源的兒茶酚胺能夠調(diào)節(jié) T細胞的增殖、分化等［1-3］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞、變形為主要特征的慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制與CD4＋T細胞有著密切關(guān)系。CD4＋T細胞可以分為 T helper 1（Th1）、Th2、Th17和 regulatory T（Treg）細胞四個亞群。Th1細胞主要分泌致炎細胞因子 IFN-γ、IL-2等；Th2細胞主要分泌抗炎細胞因子 IL-10、IL-4等；Th17細胞分泌致炎細胞因子 IL-17、IL-22等；Treg細胞主要分泌抗炎細胞因子TGF-β等。Th1／Th2的功能失衡在 RA的發(fā)病過程起著非常重要的作用，Th17和 Treg細胞也參與了RA的發(fā)病過程［4］。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）是最常見最可靠的 RA動物模型，它比較好地復(fù)制了人類的 RA疾病特點。本實驗室最近的研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠滑膜組織中CD4＋T細胞表達的 TH增多［5］。那么在CIA的發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴組織中的CD4＋T細胞亞群是否發(fā)生 TH表達的改變，且作用如何尚不十分清楚。據(jù)此，本研究利用CIA小鼠模型，觀察CIA疾病過程中腸系膜淋巴結(jié)中CD4＋T細胞亞群表達TH的變化及作用，從而為CD4＋T細胞亞群來源的兒茶酚胺參與 RA的發(fā)病機制提供進一步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性 DBA／1小鼠 36只，8～10周齡，平均體質(zhì)量為 （18±2）g，隨機分為對照組、35天模型組和55天模型組（n＝12）。小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，室內(nèi)喂養(yǎng)一周后用于實驗。

1.2 主要試劑

雞 II型膠原（collagen II，CII）購于 Sigma公司；佛氏完全佐劑 （complete freund’s adjuvant，CFA）購于 Chondrex公司；脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）購于 Sigma公司；TH抗體購于 Millipore公司；IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4、IL-17、IL-22、TGF-β、T-bet、ROR-γt、GATA-3、Foxp3、β-actin抗體均購于 Santa cruz公司；莫能霉素 （monensin）、離子霉素 （ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇 （phorbolmyristic acetate，PMA）、FITC標記的抗 CD4抗體、APC標記的抗 IFN-γ、IL-17、IL-4、CD25抗體均購于BD公司。

1.3 CIA模型制備及模型成功判定標準

用 0.1 mol／L冰醋酸在冰浴中充分溶解 CII，使終質(zhì)量濃度為 2 mg／ml，置于 4℃ 冰箱過夜后，與CFA等體積混合，充分乳化制成膠原乳劑。制備模型時，在小鼠尾根部多點皮內(nèi)注射 0.1 ml膠原乳劑，初次免疫后第21天在腹腔注射該膠原乳劑0.1 ml激發(fā)免疫，第28天腹腔注射LPS20μg加速關(guān)節(jié)炎發(fā)生。關(guān)節(jié)炎分級評估：0分，所有的關(guān)節(jié)無任何紅腫；1分，輕度的紅和（或）腫；2分，顯著的紅腫；3分，關(guān)節(jié)僵硬或運動受限。每只小鼠所有關(guān)節(jié)均被評分，最高分為12分。

1.4 ELISA法檢測血清中抗CII IgG抗體水平

初次免疫后第35天和55天，對小鼠進行麻醉、眼靜脈取血，37℃ 靜置 1 h，離心（3 000 r／min，15 min），取血清，-20℃保存。CII包被 96孔 ELISA培養(yǎng)板。根據(jù)文獻［6］方法進行檢測。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

在初次免疫后第35天和55天，取小鼠腸系膜淋巴結(jié)，加入組織裂解液 （100 mg／ml）勻漿，12 000 r／min離心 10 min，取上清，以 2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）法測定蛋白濃度。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h后孵一抗（1∶200），4℃包被過夜，熒光標記羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）或熒光標記羊抗兔 IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h后 Odyssey雙紅外激光掃描系統(tǒng)掃描分析。

1.6 流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞表達TH的CD4＋T細胞亞群數(shù)目的變化

在初次免疫后第35天和55天，分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的淋巴細胞，以1×107cells／ml的密度加入12孔板，同時每孔加入 PMA（50 ng／ml）、離子霉素 1μmol／L和莫能霉素 2μmol／L，37℃ 、5%CO2孵育5 h，收集細胞，進行細胞表面CD4分子、CD25分子、胞內(nèi) IFN-γ、IL-17和 IL-4因子及 TH抗體染色，利用 BD公司 FACS Array流式細胞儀進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DBA／1小鼠注射膠原乳劑后的臨床評分和血清中抗CII IgG抗體水平的變化

小鼠經(jīng) CII免疫后第31天開始，相繼出現(xiàn)明顯的RA癥狀，小鼠表現(xiàn)為萎靡、飲食及運動減少、舔足且踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯炎性紅腫，在發(fā)病早期（初次免疫后第35天）和發(fā)病晚期（初次免疫后第 55天）臨床評分均升高。CIA小鼠血清中抗 CII IgG抗體的水平明顯高于對照組，且發(fā)病晚期與發(fā)病早期相比明顯降低，兩者之間有顯著性差異（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Clinical score and anti-CIIIgGlevel in serum in CIA mice（，n＝8）

Tab.1 Clinical score and anti-CIIIgGlevel in serum in CIA mice（，n＝8）

CIA：Collagen-induced arthritis**P＜0.01 vs intact；＃＃P＜0.01 vs CIA（day 35）

Group Clinical score Anti-CII IgGlevel Intact 0 0.22±0.14 CIA（day 35） 8.75±1.75 3.89±0.16**CIA（day 55） 8±1.15 3.47±0.19**＃＃

2.2 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中致炎細胞因子和抗炎細胞因子表達的變化

CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中致炎細胞因子 IFN-γ、IL-2、IL-17和 IL-22的表達較對照組明顯增加。其中IL-17的表達在發(fā)病晚期較發(fā)病早期明顯下降，但仍顯著高于對照組。IFN-γ、IL-2和 IL-22的表達在發(fā)病早期和發(fā)病晚期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中抗炎細胞因子 IL-4、IL-10和 TGF-β的表達均顯著低于對照組，但在發(fā)病早期和發(fā)病晚期兩個時間點之間沒有顯著性差異（圖 1）。

Fig.1 Expression of proinflammatory and antiinflammatory cytokines in mesenteric lymph nodes of CIA mice（，n＝3）

2.3 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中 Th1、Th17、Th2和Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子表達的變化

CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th1細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子 ROR-γt的表達與對照組比較均明顯增加，在發(fā)病早期和晚期兩個時間點之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期，腸系膜淋巴結(jié)中Th2細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達與對照組相比均沒有顯著性差異（圖2）。

2.4 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中TH表達的變化

此外，我們檢測了CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中TH表達的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中 TH的表達顯著增加，在發(fā)病早期和發(fā)病晚期兩個時間點之間無顯著性差異（圖3）。

Fig.2 Expression of Th1-，Th17-，Th2-and Treg-related transcription factors in mesenteric lymph nodes of CIA mice（，n＝3）

2.5 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中表達TH的CD4＋T細胞亞群的數(shù)目的變化

為了說明在CIA發(fā)生發(fā)展過程中 CD4＋T細胞亞群即 Th1、Th17、Th2和 Treg細胞是否表達 TH，且變化如何，我們分離出小鼠腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細胞，用流式細胞術(shù)檢測了 CD4＋T細胞中各亞群以及表達 TH的 CD4＋T細胞各亞群的數(shù)目的變化。CD4＋T細胞中 IFN-γ＋細胞代表 Th1細胞，IL-17＋細胞代表 Th17細胞，IL-4＋細胞代表 Th2細胞，CD25＋細胞代表Treg細胞。首先，與對照組相比，CIA小鼠的CD4＋T細胞中 TH＋的細胞數(shù)顯著增加，在發(fā)病早期和發(fā)病晚期之間無顯著性差異（表2）。其次，CIA小鼠的 Th1和 Th17細胞的數(shù)目以及表達 TH的Th1和Th17細胞的數(shù)目與對照組相比均顯著升高，且發(fā)病晚期與發(fā)病早期相比有所下降（表2）。此外，Th2細胞的數(shù)目在發(fā)病早期顯著降低，而在發(fā)病晚期與對照組相比無顯著性差異。CIA小鼠的Treg細胞的數(shù)目與對照組相比均無顯著性差異。CIA小鼠的表達TH的Th2和Treg的數(shù)目與對照組相比無顯著性差異（表2）。

Tab.2 Changes of number of TH-expressing CD4＋T cell subsets in mesenteric lymph nodes of CIA mice，n＝4）

Tab.2 Changes of number of TH-expressing CD4＋T cell subsets in mesenteric lymph nodes of CIA mice，n＝4）

CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact； ＃＃P＜0.01 vs CIA（day 35）

Cell number（%） Intact CIA（day 35） CIA（day 55）TH＋cells 29.38±4.30 37.96±5.81**35.04±1.73**IFN-γ＋cells 55.58±2.20 68.15±3.79**60.38±2.5*＃＃IFN-γ＋TH＋cells 26.28±2.79 36.98±1.98**30.53±1.72*＃＃IL-17＋cells 8.85±0.79 19.48±2.41**14.88±1.58**＃＃IL-17＋TH＋cells 2.38±0.48 7.23±0.75**4.58±0.51**＃＃IL-4＋cells 27.25±1.60 24.1±1.40**25.35±1.39 IL-4＋TH＋cells 10.20±1.17 10.30±0.98 10.20±0.77 CD25＋cells 9.63±0.79 9.55±1.15 9.18±1.01 CD25＋TH＋cells 3.33±0.37 3.90±0.78 3.70±0.51

3 討論

從CIA發(fā)病過程中的臨床表現(xiàn)可以看出小鼠關(guān)節(jié)顯著的炎癥反應(yīng)。有研究報道，機體對 CII的免疫反應(yīng)與 CIA的發(fā)生有關(guān)［6］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在初次免疫后第35天 和 55天，CIA小鼠血清中抗CII IgG抗體的水平明顯高于對照組，且初次免疫后第55天的抗體水平與初次免疫后第35天相比明顯降低。本實驗室先前的研究發(fā)現(xiàn)，在 CIA的發(fā)生發(fā)展過程中，先出現(xiàn)劇烈的急性炎癥反應(yīng)，而后隨著時間的推移，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)的骨質(zhì)損傷反應(yīng)［5］。提示，初次免疫后第35天（發(fā)病早期）是一個急性炎癥期，而初次免疫后第55天（發(fā)病晚期）則處于慢性反應(yīng)期。

本研究中我們發(fā)現(xiàn) CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th1和Th17細胞分泌的致炎細胞因子的表達均顯著增加，Th2和Treg細胞分泌的抗炎細胞因子的表達均顯著減少。這些結(jié)果說明在 CIA的發(fā)生過程存在著致炎細胞因子／抗炎細胞因子的失衡，而且在疾病晚期，致炎細胞因子／抗炎細胞因子的失衡有所緩和。另外，CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中 Th1和 Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達增加，CD4＋T細胞中Th1和Th17細胞的數(shù)目與對照組相比均顯著升高。Th2和Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達沒有變化，CD4＋T細胞中 Th2細胞的數(shù)目顯著降低，Treg細胞的數(shù)目與對照組相比無顯著性改變，說明 CIA的發(fā)病過程中還存在著Th1／Th2和 Th17／Treg細胞比例的失衡。這些結(jié)果說明，CD4＋T細胞各亞群Th1、Th17、Th2和 Treg細胞均參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，主要表現(xiàn)為Th1和Th17細胞的致炎反應(yīng)增強和Th2和Treg細胞的抗炎反應(yīng)減弱，提示在 CIA發(fā)病過程中，腸系膜淋巴結(jié)中存在 Th1／Th2和Th17／Treg細胞免疫反應(yīng)的失衡。此外，在疾病的后期 Th1／Th2和 Th17／Treg細胞免疫反應(yīng)趨向平衡。

CIA小鼠的炎癥組織中能產(chǎn)生兒茶酚胺的細胞是多樣的，如巨噬細胞、B細胞、中性粒細胞均被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生兒茶酚胺［7］。既往研究表明，CIA小鼠的淋巴組織中 TH＋或 VMAT-2＋細胞數(shù)顯著高于對照組［8］。本實驗室最近的研究表明，在 CIA小鼠的關(guān)節(jié)滑膜中的CD4＋T細胞可以表達 TH，且表達增多［5］。本研究的結(jié)果顯示 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中TH的表達也增多。流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示CD4＋T細胞中 TH＋細胞數(shù)目顯著增多，提示 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中增多的兒茶酚胺有部分來自于CD4＋T細胞。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，CD4＋T細胞中表達TH的Th1和 Th17細胞的數(shù)目與對照組相比顯著升高，而表達TH的 Th2和 Treg細胞的數(shù)目與對照組相比無顯著改變，提示這種兒茶酚胺的增多主要來源于 Th1和 Th17細胞的作用。在 RA中，Th1和Th17細胞來源的兒茶酚胺的作用及意義是復(fù)雜的。在 CIA的發(fā)病晚期，Th1和Th17細胞產(chǎn)生的兒茶酚胺比發(fā)病早期有所減少，這與發(fā)病晚期致炎細胞因子／抗炎細胞因子的失衡有所緩和并相平行，提示Th1和Th17細胞來源的兒茶酚胺可能有抑制炎癥反應(yīng)的作用。有研究報道，兒茶酚胺可以抑制 Th1細胞的細胞因子 IFN-γ和 IL-2的產(chǎn)生，而增加 Th2細胞的細胞因子 IL-10和 IL-4的產(chǎn)生［9］。過繼轉(zhuǎn)移TH＋細胞可緩解 CIA的癥狀，CIA小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射利血平（囊泡單胺轉(zhuǎn)運體-2的阻斷劑，可增加細胞內(nèi)的兒茶酚胺），其局部炎癥也可得到緩和［10］。提示在 CIA發(fā)病過程中，Th1和 Th17細胞產(chǎn)生的兒茶酚胺有可能通過調(diào)節(jié)機體致炎細胞因子／抗炎細胞因子的平衡，從而使局部炎癥得到緩和，但具體的作用機制還需要通過深入的實驗來闡明。

綜上所述，CIA小鼠臨床評分和血清中抗 CII IgG抗體水平升高，發(fā)病過程中腸系膜淋巴結(jié)中Th1和Th17細胞的致炎反應(yīng)增強以及Th2和Treg細胞的抗炎反應(yīng)減弱。CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中 CD4＋T細胞表達TH增多，這種增多主要來自于 Th1和Th17細胞的作用。發(fā)病晚期 Th1和Th17細胞表達的TH有所減少，與 CIA炎癥的緩和相平行，提示Th1和Th17細胞產(chǎn)生的兒茶酚胺能發(fā)揮抗炎效應(yīng)，緩和局部炎癥。

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