華紅偉 姜峰 胡薇薇 李靜 丁罡,

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150；3.上海市崇明新華癌痛轉(zhuǎn)化研究所，上海 202150)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第三大癌癥死亡原因[1]，HCC患者的5年生存率僅18%[2]。HCC的發(fā)生機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是細(xì)胞外基質(zhì)非膠原糖蛋白中的一種鈣結(jié)合蛋白，也稱骨連接蛋白(osteonectin)、基底膜-40(BM-40)、43k蛋白，由Termine等[3]在1981年發(fā)現(xiàn)。SPARC參與細(xì)胞的黏附和遷移、細(xì)胞周期的調(diào)控、血管的生成和增殖、組織的更新和修復(fù)等多種生理過程。本研究探討了SPARC在HCC中的表達(dá)與糖酵解作用的關(guān)系，以期為HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人HCC細(xì)胞株HepG2購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心細(xì)胞庫(American Type Culture Collection，ATCC)。培養(yǎng)條件：應(yīng)用含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37.5 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑 SPARC質(zhì)粒及SPARC siRNA購(gòu)自北京傲銳東源生物科技有限公司；β-actin小鼠單抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Oligofectamine、Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司；乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司。

1.3 方法

1.3.1 SPARC質(zhì)粒/SPARC siRNA的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，取出處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔(3～5)×105細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合率在70%～80%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；將SPARC質(zhì)粒、SPARC siRNA加入不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基，共100 μL，輕輕搖勻；以O(shè)ligofectamine作為轉(zhuǎn)染載體，SPARC質(zhì)粒/SPARC siRNA(μg)和Oligofectamine(μL)的比例為1∶2，用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基稀釋至100 μL，在室溫下孵育5 min；將稀釋后的SPARC質(zhì)粒/SPARC siRNA與稀釋后的Oligofectamine混合(共200 μL)，在室溫下孵育30 min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱孵育24 h。24 h后，換用正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 采用比色法檢測(cè)葡萄糖攝取量 將細(xì)胞以每孔(1～3)×105的密度接種于12孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，檢測(cè)前置于-20 ℃；采用葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)高速離心后上清液中的總蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定總蛋白濃度；應(yīng)用酶標(biāo)儀在563 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3.3 采用比色法檢測(cè)乳酸生成量 檢測(cè)前1 d，將細(xì)胞以每孔2×105的密度接種于24孔培養(yǎng)板；去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)以400 r/min離心5 min，吸去上清液；按照乳酸檢測(cè)試劑盒說明書加入樣本、酶工作液及顯色劑，漩渦混勻，37 ℃孵育10 min，然后加入終止劑終止反應(yīng)；在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析結(jié)果。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

轉(zhuǎn)染SPARC質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取量較對(duì)照組明顯下降，吸光度由(100.00±4.80)%降低至(61.20±4.07)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染SPARC siRNA后的HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取量較對(duì)照組明顯增加，吸光度由(100.00±8.20)%上升至(157.60±4.80)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

轉(zhuǎn)染SPARC質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的乳酸生成量較對(duì)照組明顯下降，吸光度由(100.00±5.20)%降低至(64.63±4.18)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染SPARC siRNA后的HepG2細(xì)胞的乳酸生成量較對(duì)照組明顯增加，吸光度由(100.00±8.30)%上升至(175.26±5.46)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

糖酵解是細(xì)胞能量代謝的重要途徑之一。惡性腫瘤細(xì)胞即使氧氣供應(yīng)充分，但獲取能量還主要靠有氧糖酵解，以滿足自身快速增殖的需要，腫瘤細(xì)胞這種活躍的有氧糖酵解特性被稱為Warburg效應(yīng)[4]。通過抑制糖酵解而阻斷腫瘤細(xì)胞的能量來源，以抑制腫瘤生長(zhǎng)，這是近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

SPARC具有多種生物學(xué)特性。研究[5]發(fā)現(xiàn)，SPARC與惡性腫瘤的大小、病理類型、侵襲度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。但是，目前關(guān)于SPARC在原發(fā)性HCC中的研究較少，其作用及相關(guān)機(jī)制尚不明了；關(guān)于SPARC與惡性腫瘤糖酵解過程的關(guān)系鮮見報(bào)道。

本研究以人HCC細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象，探討SPARC在HCC中的表達(dá)與糖酵解過程的關(guān)系。乳酸是糖酵解過程的最終產(chǎn)物，惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解活躍，故產(chǎn)生的乳酸也相應(yīng)增加。因此，本研究分別將SPARC質(zhì)粒及SPARC siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞后，采用比色法觀察細(xì)胞葡萄糖攝取量和乳酸生成量的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SPARC質(zhì)粒的細(xì)胞的葡萄糖攝取量及乳酸生成量明顯下降；轉(zhuǎn)染SPARC siRNA后，細(xì)胞的糖酵解作用較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示SPARC在HCC細(xì)胞的糖代謝過程中具有重要作用。本研究結(jié)果提示，HCC中SPARC可能是一種腫瘤抑制物，這與Atorrasagasti等[6]的研究結(jié)果相似；SPARC可能通過抑制糖酵解過程而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，這為HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移途徑的研究提供了新的思路。但是，也有研究[7]報(bào)告，SPARC在HCC的基質(zhì)中呈高表達(dá)水平，并與HCC的惡性程度有關(guān)。因此，關(guān)于SPARC在HCC中的作用，尚待進(jìn)一步探究。

綜上所述，SPARC可能具有抑制HCC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)功能，可能通過抑制糖酵解作用而阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，但其在不同類型的HCC細(xì)胞中的功能及相關(guān)作用機(jī)制尚待深入研究。

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