齊 斌 綜述 余麗梅 審校

microRNA概述及其研究進(jìn)展

齊 斌 綜述 余麗梅 審校

microRNA是一類長(zhǎng)約20～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞衰老、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生命進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用，在抗衰老和多種疾病治療方面具有巨大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，microRNA在組織工程等領(lǐng)域均成為研究熱點(diǎn)。本文對(duì)microRNA的生物合成過(guò)程、作用機(jī)制，及其與衰老相關(guān)疾病的關(guān)系和臨床應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

組織工程小核糖核酸合成過(guò)程作用機(jī)制細(xì)胞衰老臨床應(yīng)用

組織工程興起于上世紀(jì)80年代，其核心是利用細(xì)胞與生物材料研究開(kāi)發(fā)具有生物活性的人工替代物，以維持、恢復(fù)和提高人體受損組織功能。種子細(xì)胞是組織工程的三大核心之一，獲取足量且優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞是重建組織器官的基礎(chǔ)，是開(kāi)展組織工程研究的前提。由最初的各種體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞，到現(xiàn)在以各種類型的干細(xì)胞作為主要的種子細(xì)胞，組織工程取得了快速的發(fā)展。microRNA作為重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)各種干細(xì)胞的增殖、分化、干性維持等都具有重要的調(diào)節(jié)作用。其對(duì)體外培養(yǎng)過(guò)程中，維持細(xì)胞的增殖能力，以獲取足夠數(shù)量種子細(xì)胞，維持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的干性，以及誘導(dǎo)體細(xì)胞重編以發(fā)現(xiàn)新的種子細(xì)胞等方面都具有重要的研究?jī)r(jià)值。另外，microRNA又可以作為生物標(biāo)記物，在種子細(xì)胞的優(yōu)選方面發(fā)揮重要作用。

1 microRNA的發(fā)現(xiàn)及合成過(guò)程

1993年，Lee等對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的早期發(fā)育進(jìn)行遺傳篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種不編碼蛋白質(zhì)的基因：lin-4。lin-4并不編碼蛋白，但能夠產(chǎn)生一對(duì)小的RNA。后來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到lin-4是一類豐富的小的調(diào)控RNA的一員，即所謂的microRNA。

microRNA是一類長(zhǎng)約21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，作用于靶基因的3'非編碼端，抑制靶模板RNA（mRNA）的翻譯，或使其降解來(lái)發(fā)揮作用，在干細(xì)胞的更新、分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中，都發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。microRNA成熟之前要經(jīng)歷一系列的改變，經(jīng)典的microRNA合成途徑是，首先在細(xì)胞核內(nèi)microRNA表現(xiàn)為較長(zhǎng)的RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物—初級(jí)微小RNA（pri-microRNAs），大約50%的microRNA具有自己的啟動(dòng)子，另一半則存在于編碼或非編碼區(qū)的內(nèi)含子或外顯子中。pri-microRNA由上千個(gè)核苷酸組成，并具有發(fā)卡狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而microRNA就包含在pri-mRNA的發(fā)卡狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，當(dāng)pri-microRNA合成后，它的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)立刻被剪切下來(lái)成為pre-microRNA。這個(gè)過(guò)程是在細(xì)胞核中進(jìn)行的，由核糖核酸酶Ⅲ型蛋白Drosha進(jìn)行，且需要輔因子DGCR8（Di-George syndrome critical region gene 8）的參與，Drosha與DGCR8共同組成微處理器復(fù)合體。下一步，pre-microRNA經(jīng)Ran-GTP依賴性核漿轉(zhuǎn)運(yùn)子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exporting-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，并且此過(guò)程中其序列和結(jié)構(gòu)的完整性得到保護(hù)。在轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中后，轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體去磷酸化，GTP轉(zhuǎn)變成GDP，從而釋放pre-microRNA，然后由另一種RNaseⅢ—Dicer酶把pre-microRNA剪切為小的雙鏈RNA（dsRNA），雙鏈中的一條為成熟的microRNA，另一條則為它的互補(bǔ)鏈。然后下一步加工過(guò)程將用到TRBP（Transactivation response RNA-Bindng domain）。它能夠與dsRNA結(jié)合域結(jié)合然后富集阿古爾蛋白（Ago2），Ago2是RISC（RNA induced Silencing Complex）的主要組成部分。RISC的作用是選擇性結(jié)合兩條鏈中5'端熱力學(xué)穩(wěn)定性最差的那一條，那么這條鏈即為成熟的microRNA，另一條則為互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈沒(méi)有結(jié)合RISC，因此在體內(nèi)應(yīng)是趨向于降解的，但是microRNA文庫(kù)法檢測(cè)不同組織中的microRNA時(shí)，仍能檢測(cè)到這條互補(bǔ)鏈。Ro等[2]對(duì)小鼠和人的969個(gè)microRNA進(jìn)行分析時(shí)證實(shí)，其中有117個(gè)是互補(bǔ)鏈，說(shuō)明也可能存在雙鏈的microRNA。而且不論是成熟的microRNA，或者它的互補(bǔ)鏈，都具有組織特異性，如miR-30e-3p在胃組織中富集，而它的互補(bǔ)鏈miR-30e-5p則在胰腺組織中含量豐富。

2 microRNA的生物學(xué)作用及機(jī)制

隨著microRNA表達(dá)譜芯片、生物信息學(xué)技術(shù)等新技術(shù)的應(yīng)用，越來(lái)越多的microRNA在動(dòng)植物甚至病毒中被發(fā)現(xiàn)。新版本的miR Base 20.0數(shù)據(jù)顯示，microRNA發(fā)夾前體序列已升至24 521條，成熟microRNA序列升至30 424條。小鼠成熟的microRNA新增至1 908條，大鼠成熟的microRNA新增至728條，人類成熟的microRNA則新增至2 578條。

microRNA在動(dòng)植物的生命過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。Palatnik等證實(shí)，miR-Jaw控制植物葉和其他細(xì)胞分裂。Millar等證明，miR-159在擬南芥中通過(guò)調(diào)控MYB33和MYB65兩種轉(zhuǎn)錄基因，調(diào)節(jié)植物的生殖發(fā)育。mir-164通過(guò)對(duì)靶基因CUP SHAPED COTYLEDON(CUP)1,2等的作用，調(diào)控分裂組織的邊界和胚胎、營(yíng)養(yǎng)器官和花的形成，miR-164過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致花器官或葉子的融合。Brennecke等在果蠅中發(fā)現(xiàn)，microRNA-bantam作用于基因hid，并負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性死亡。Giraldez等在dicer突變型斑馬魚的胚胎中注射miR-430，有效地改變了大腦畸形，也可在某種程度上調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育。

在人類衰老相關(guān)性疾病中，如心腦血管性疾病、纖維化疾病、神經(jīng)退行性疾病等，都存在microRNA差異性改變。Hebert等發(fā)現(xiàn)，阿茲海默癥患者的大腦組織中miR-29的表達(dá)量下調(diào)。Persengiev等發(fā)現(xiàn)，在人的小腦衰老過(guò)程中，miR-144表達(dá)量升高。Drummond等發(fā)現(xiàn)，在人類骨骼肌細(xì)胞衰老過(guò)程中Let-7b和Let-7c的表達(dá)量升高。microRNA的異常表達(dá)也與許多疾病相關(guān)，如癌癥、精神分裂癥、腎功能障礙、妥瑞綜合癥、牛皮癬、原發(fā)性肌肉疾病、脆性X染色體綜合癥、慢性肝炎、真性紅細(xì)胞增多、艾滋病和肥胖等[3]?，F(xiàn)已證實(shí)，microRNA廣泛存在于真核生物體細(xì)胞中，是最大的基因家族之一，大約占整個(gè)基因組的1%[4]，每個(gè)microRNA都具有上百甚至上千個(gè)靶基因，如Calin等[5]證明miR-15a/16-1家族能夠直接或間接調(diào)控白細(xì)胞中14%的基因。至今人們已發(fā)現(xiàn)人類有1/3的基因受到microRNA的調(diào)控[6]。

microRNA在細(xì)胞的衰老過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，而細(xì)胞衰老是導(dǎo)致組織和機(jī)體衰老的重要因素。如Menghini等發(fā)現(xiàn)，microRNA-217能夠同時(shí)抑制SIRT1和FOXO1的去乙?；?，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。Mudhasani等發(fā)現(xiàn)，一些microRNA的缺失能夠?qū)е翽53和P19的表達(dá)量升高，使胚胎成纖維細(xì)胞衰老。Bai等發(fā)現(xiàn)，miR-34a和miR-335在腎臟系膜細(xì)胞衰老過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體中的活性氧自由基升高，引起細(xì)胞的衰老。

microRNA也被證實(shí)在胚胎干細(xì)胞中，對(duì)干細(xì)胞的自我更新、多向分化有著重要的調(diào)控作用。首次發(fā)現(xiàn)的調(diào)控分化證據(jù)來(lái)自小鼠和人類胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）的研究。microRNA的缺失會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞增殖和分化能力缺失，而且dicer酶缺失的小鼠也會(huì)在發(fā)育早期死亡[7]。研究表明，胚胎干細(xì)胞中表達(dá)特異的microRNA，如Morin等[8]的多項(xiàng)研究證明，在鼠或人的ESC分化過(guò)程中存在一系列的microRNA差異表達(dá)。干細(xì)胞中這些microRNA的表達(dá)水平并不是很高，但microRNA在不同細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)水平的差異，也間接證明了microRNA對(duì)干細(xì)胞特性的調(diào)節(jié)作用。

microRNA調(diào)節(jié)基因在轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，而且對(duì)于hESC的自我更新能力、干性的維持[9-10]和分化[8]至關(guān)重要。干細(xì)胞中的核心轉(zhuǎn)錄因子，如Oct4、Sox2和Nanog能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞中特有的基因表達(dá)，并抑制分化[11]，而如果將這些核心轉(zhuǎn)錄子導(dǎo)入鼠或人的成體細(xì)胞中，則能夠?qū)⒊审w細(xì)胞重編程為細(xì)胞表型、功能都與胚胎干細(xì)胞類似的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSCs）。而一些microRNA已經(jīng)證明與這些核心的轉(zhuǎn)錄因子有直接的聯(lián)系，如miR-145抑制核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Sox2、kif4的3'UTR端[12]。miR-134、miR-296、和miR-470靶向抑制小鼠Nanog、Oct-4、Sox2的DNA編碼序列[13]。

成熟的microRNA在Ago2等蛋白的引導(dǎo)下，結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing coplex，RISC），并由RISC介導(dǎo)，通過(guò)microRNAs 5'端第2～7堿基的8個(gè)核苷酸序列，即“種子序列”（Seed sequence），與靶向mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'untranslate region，3'UTR）結(jié)合，對(duì)靶基因進(jìn)行切割或翻譯抑制，從而調(diào)控基因的表達(dá)。實(shí)際上，大多數(shù)的生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)microRNA的靶基因時(shí)，都是遵循這個(gè)種子序列配對(duì)的原則。大量研究也表明，遵循該種子序列配對(duì)方法預(yù)測(cè)的靶基因大部分是正確的，也就有了“種子規(guī)律”[14]這一經(jīng)典的預(yù)測(cè)microRNA干預(yù)靶基因的理論方法。但是，也有些microRNA不遵循此規(guī)律，而仍然起到基因沉默的作用[15]。近期的研究表明，microRNA除了作用于mRNA的3'UTR的經(jīng)典沉默機(jī)制，還可以作用于5'UTR[16]、啟動(dòng)子區(qū)[17]，甚至是mRNA的編碼區(qū)[13]。而且，microRNA對(duì)靶基因的選擇并不要求種子序列完全配對(duì)。因此，一個(gè)microRNA可能同時(shí)抑制上百個(gè)不同的信使RNA[18]。所以，microRNA的作用也可視為它對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)抑制的協(xié)同作用結(jié)果。

3 microRNA的臨床應(yīng)用

2008年，Lawire等[19]在血液中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)的microRNA，他證明mir-21和mir-155的含量增加與否，能夠鑒別B細(xì)胞淋巴瘤患者與健康人，在microRNA研究領(lǐng)域開(kāi)拓了一條新的研究方向。隨后大量研究在血液、尿液、唾液和其他體液中發(fā)現(xiàn)了與許多疾病相關(guān)的microRNA。2010年，Weber等[20]在健康成人的12種體液中提取了上百種microRNA。他們檢測(cè)了血漿、唾液、眼淚、尿液、羊水、乳汁、支氣管分泌物、腦脊液、腹水、精液中microRNA的表達(dá)量，不同體液中檢測(cè)到的microRNA數(shù)量從200到450個(gè)不等。而且證明了不同的體液中，部分microRNA的表達(dá)是特異性的，如mir-577在腦脊液中特異表達(dá)。而且不同于信使RNA，循環(huán)系統(tǒng)中的microRNA穩(wěn)定性非常好，即使反復(fù)凍融或者在長(zhǎng)時(shí)間的室溫下仍可保持穩(wěn)定[21]。且循環(huán)系統(tǒng)中的microRNA還有個(gè)重要的特性，它們是游離態(tài)的，不論是囊泡中的microRNA還是與蛋白結(jié)合的microRNA[22-23]。microRNA的這些特性都表明，microRNA有希望成為疾病診斷的重要依據(jù)。如Chen等[24]對(duì)10個(gè)血清microRNA組合進(jìn)行研究，在他的研究中有200例非小細(xì)胞型肺癌和110例對(duì)照組，檢測(cè)的靈敏度和特異性分別能夠達(dá)到92.5%和90%。且在回顧性研究中，這10個(gè)microRNA組合的檢測(cè)也能夠達(dá)到7個(gè)患者中成功預(yù)測(cè)6個(gè)患者的非小細(xì)胞肺癌，并且比現(xiàn)在的檢測(cè)方法提早33個(gè)月。在相似的研究中，Boeri等[25]以吸煙人群血漿中的15個(gè)microRNA作為檢測(cè)對(duì)象來(lái)預(yù)測(cè)早期肺癌，敏感性達(dá)到75%，特異性達(dá)到100%。Fu等[26]檢測(cè)了肺結(jié)核病人血清中的microRNA變化，有59個(gè)下調(diào)，33個(gè)上調(diào)，其中miR-29a具有最好的預(yù)測(cè)價(jià)值，感染患者中表達(dá)上升了11倍。通過(guò)mir-29a檢測(cè)結(jié)核患者，敏感性達(dá)83%，特異性達(dá)到80%。Henegan等[27]通過(guò)檢測(cè)患者血清中miR-195來(lái)診斷乳腺癌，敏感性87.7%，特異性91%。miR-195能夠在乳腺癌早期就被檢測(cè)到，這時(shí)腫瘤直徑還小于2 cm。尤為重要的是，mir-195與腫瘤的大小具有明顯的相關(guān)性。當(dāng)患者實(shí)施乳腺癌切除術(shù)后，mir-195的水平恢復(fù)正常，表明miR-195也能夠作為術(shù)后隨診的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，血液中的microRNA可作為鑒別不同原因肝損傷的工具，敏感性和特異性均超過(guò)96.9%。如檢測(cè)miR-375、miR-10a、和miR-223可用來(lái)鑒別乙型肝炎患者和健康人，敏感性99.3%，特異性98.8%。

4 展望

隨著越來(lái)越多的microRNA被發(fā)現(xiàn)，其生理功能和調(diào)控機(jī)制也越來(lái)越清楚。胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞作為組織工程重要的種子細(xì)胞，microRNA對(duì)各種生物學(xué)行為及功能的調(diào)節(jié)作用將使microRNA在干細(xì)胞的組織工程應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)查閱人類microRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// 202.38.126.151/hmdd/miRNA/md/），來(lái)查找與特定疾病相關(guān)的microRNA。microRNA調(diào)節(jié)異常和人類衰老相關(guān)性疾病等具有相關(guān)性，可通過(guò)干預(yù)單個(gè)或多個(gè)microRNA，觀察microRNA對(duì)細(xì)胞衰老和個(gè)體衰老或相關(guān)疾病的影響，發(fā)掘microRNA在抗衰老或疾病治療方面的潛力。同時(shí)，作為一種生物標(biāo)記物，也將在種子細(xì)胞優(yōu)選和疾病的診斷、預(yù)防方面發(fā)揮潛力。

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Overview and Research Progress of microRNA

QI Bin,YU Limei.
Zunyi Medical college,Zunyi 563000,China.

【Summary】The microRNA is only 20-22 nucleotides in length and can work as post-DNA transcription regulator for gene expression.It has an important regulating role in the life process such as cell aging,disease and so on.So microRNA has a huge potential for anti-aging and disease treatment.Nowadays it has become one of the most intense interests to the tissue engineering and other area of medicine.In this paper,the biogenesis,mechanism,relationship with cell aging and ageassociated diseases and the clinical application of microRNA were reviewed.

Tissue engineering;microRNA;Biogenesis;Mechanism;Cell ageing;Clinical application

Q522

B

1673－0364（2014）06－03－03

2014年5月11日；

2014年6月30日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.016

563000貴州省遵義市遵義醫(yī)學(xué)院。