常振華，何 成

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南714000；2.渭南市畜牧技術(shù)推廣中心，陜西渭南714000）

甘油三酯是乳脂和體脂的主要成分，其中磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（1－acyl－sn－glycerol－3－pho sphate acyltransferase，AGPAT）是甘油三酯合成的關(guān)鍵酶［1］。研究發(fā)現(xiàn)，人AGPAT有8種異構(gòu)體。鼠的AGPAT1基因和AGPAT3 基因在多種組織中表達(dá)，而AGPAT2 基因、AGPAT4 基因和AGPAT5基因的表達(dá)具有組織特異性［2］，AGPAT6基因在小鼠的內(nèi)臟、乳腺上皮細(xì)胞及皮下脂肪中高水平表達(dá)［3］。缺失AGPAT6基因的小鼠泌乳期會出現(xiàn)乳腺小泡和導(dǎo)管不發(fā)達(dá)的癥狀，而且會導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管和乳腺上皮細(xì)胞中乳脂肪滴的大小和數(shù)量都顯著下降［4］。因此，AGPAT6 酶對乳脂肪的產(chǎn)生至關(guān)重要，AGPAT6基因可作為影響奶牛泌乳性能的候選基因。昝林森等［5］發(fā)現(xiàn)AGPAT6基因?qū)伤固鼓膛Ｈ橹屎湍坍a(chǎn)量有影響，而在奶山羊中尚未有AGPAT6基因多態(tài)性對產(chǎn)奶性狀的報道。為此本文采用PCR－RFLP技術(shù)分析了西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊品種AGPAT6基因多態(tài)性對產(chǎn)奶性狀的影響，旨在為其產(chǎn)奶性狀選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

從陜西千陽縣西農(nóng)薩能奶山羊種羊場（202只）和西北農(nóng)林科技大學(xué)種羊場（66只）采集西農(nóng)薩能奶山羊（SN）268份血樣，從陜西省三原縣關(guān)中奶山羊良種繁育中心采集關(guān)中奶山羊（GZ）血樣281份，共計549 份血樣。每個個體采集血液10 mL，加ACD 抗凝劑帶回實驗室，－20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?；同時收集549頭奶山羊的羊奶進(jìn)行奶成分分析，收集西農(nóng)薩能奶山羊268只羊的產(chǎn)奶量。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取與AGPAT6基因引物奶山羊DNA 提取參照Chen［6］的方法。本試驗所用到的引物全部參照GenBank中公布的牛的AGPAT6基因序列（NC＿007328.3），用Primer premier5.0軟件自行設(shè)計，如表1所示。

1.2.2 AGPAT6 基因PCR－RFLP 反應(yīng)條件 以奶山羊的混合DNA 池（每10個不同樣本混合成1個DNA 池）做模板進(jìn)行AGPAT6 基因的PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體系為：10×PCR Buffer 2.7 μL、dNTPs 2.0μL、上游引物（F）0.5μL、下游引物（R）0.5μL、Taq DNA 聚合酶0.4μL、DNA 模板（10ng／μL）1.0μL和超純水17.9μL，總體積是25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)次數(shù)33，72 ℃延伸10 min，4℃保存。利用PCR－RFLP技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的SNPs進(jìn)行分型。PCR－RFLP技術(shù)的具體方法為：將10×Buffer緩沖液1.0μL，超純水3.5μL，限制性內(nèi)切酶（10U／μL）0.5μL，PCR 產(chǎn)物5.0μL，合計10μL。根據(jù)限制性內(nèi)切酶說明書中的反應(yīng)溫度水浴8h，用3%的瓊脂糖電泳、成像，然后進(jìn)行基因型分析。

表1 山羊AGPAT6基因所用引物信息Table 1 Primer information of the goat AGPAT6gene

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)突變位點的基因分型結(jié)果，對測得的基因型進(jìn)行統(tǒng)計，直接計算出基因頻率和基因型頻率。用SPSS 16.0計算基因型和奶山羊經(jīng)濟(jì)性狀之間的關(guān)系，基因型與產(chǎn)奶量、奶成分關(guān)聯(lián)分析用到的線性模型為：yijklmn＝μ＋Farmi＋Breedj＋Agek＋Genotypem＋Xn＋eijklmn。式中：yijklmnpq為個體表型記錄；Farmi為場別效應(yīng)；Breedj為品種效應(yīng)；Agek為年齡效應(yīng)；Sexl為性別效應(yīng)；Markerm為標(biāo)記基因型效應(yīng)；Xn為各種二級和二級以上互作效應(yīng)，如：Farm×Breed，F(xiàn)arm×Age，F(xiàn)arm×Genotype，Breed×Age，Breed×Genotype，Age×Genotype，Breed×Age×Genogype等；eijklmn為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊AGPAT6基因多態(tài)性

通過對西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊共549個個體AGPAT6基因全部外顯子和部分5＇UTR 和3＇UTR（P1～P10位點）進(jìn)行SNP掃描，經(jīng)DNA 池測序發(fā)現(xiàn)在P1、P2、P4、P10 位點共有4 個SNPs：5＇UTR（g.152G＞C）、內(nèi)含子2（g.8124G＞A）、外顯子4（g.9263C＞G）和3＇UTR（g.16436G＞A）。其中在外顯子4（g.9263C＞G）處引起ACC（蘇氨酸）＞ACG（蘇氨酸）的同義突變，而5＇UTR、內(nèi)含子2和3＇UTR 不進(jìn)行蛋白編碼，未引起氨基酸突變。

對于發(fā)現(xiàn)的4 個多態(tài)位點，本試驗采用PCRRFLP和測序的方法去檢測。P1 基因座由于沒有相應(yīng)的酶切位點，所以采用引入酶切位點的方法來檢測這個突變，利用下游引物P1－KpnI 155位的A被突變?yōu)門 從而引入KpnI 的酶切位點（GGTACC）用來檢測g.152 G＞C 突變，對P1 位點（g.152G＞C）的PCR 產(chǎn)物（175bp）進(jìn)行分型，結(jié)果在兩個奶山羊品種中都檢測到了GG 型、GC 型和CC型三種基因型，GG 基因型表現(xiàn)175bp 1 條帶型；GC基因型表現(xiàn)175bp、150bp 和25bp 共3條帶型；CC基因型表現(xiàn)150bp 和25bp 2條帶型。

利用限制性內(nèi)切酶EcoRΙΙ對發(fā)現(xiàn)的P2 位點（g.8124G＞A）的PCR 產(chǎn)物（372bp）進(jìn)行分型，結(jié)果在兩個奶山羊品種中都檢測到了GG 型、GA 型和AA 型三種基因型，GG 型表現(xiàn)372bp 1條帶型；GA 型表現(xiàn)372bp、253bp 和119bp 共3條帶型；CC型表現(xiàn)253bp 和119bp 2條帶型。

利用限制性內(nèi)切酶NcoΙ 對發(fā)現(xiàn)的P4 位點（g.9263C＞G）的PCR 產(chǎn)物（241bp）進(jìn)行分型，在兩個奶山羊品種中都檢測到了CC 型、CG 型和GG型三種基因型，CC 型表現(xiàn)241bp 1條帶型；CG 型表現(xiàn)241bp、130bp 和111bp 共3條帶型；CC 基因型表現(xiàn)130bp 和111bp 2條帶型（見圖1）。最后，利用限制性內(nèi)切酶BglΙ對P10位點（g.16436G＞A）的PCR 產(chǎn)物（336bp）進(jìn)行分型，在兩個奶山羊品種中都檢測到了GG 型、GA 型和AA 型三種基因型，GG 基因型表現(xiàn)336bp 1條帶型；GA 基因型表現(xiàn)336bp、195bp和141bp共3條帶型；CC基因型表現(xiàn)195bp 和141bp 2條帶型。

在西農(nóng)薩能和關(guān)中奶山羊群體中，AGPAT6基因P1位點KpnΙ、P2位點EcoRII、P4位點NcoΙ和P10位點BglΙ基因頻率和基因型頻率見表2，說明基因頻率差異很大。P4位點（NcoΙ）在這兩個奶山羊品種中GG 和CG 基因型個體的產(chǎn)奶量顯著優(yōu)于CC基因型個體（P＜0.05）（表3），在兩個奶山羊品種奶成分分析上，GG基因型個體乳脂率顯著高于CC型個體（P＜0.05），GG 和CG 基因型個體乳蛋白含量極顯著高于CC 基因型個體（P＜0.01）（表4）。而P1、P2和P10位點的不同基因型對兩個奶山羊品種的產(chǎn)奶性狀影響均不顯著（P＞0.05）。

圖1 奶山羊AGPAT6 基因P4位點PCR 產(chǎn)物NcoΙ酶切多態(tài)性1.Marker I；2，3，5，7.CC基因型；4.CG 基因型；6.GG 基因型Fig.1 NcoΙdigesting polymorphism of AGPAT6－P4PCR products in dairy goat；1.Marker I；2，3，5，7.CC genotype；4.CG genotype；60GG genotype

表2 兩個奶山羊品種AGPAT6基因的基因頻率和基因型頻率Table 2 Allelic and genotypic frequencies of AGPAT6gene in two dairy goat breeds

表3 AGPAT6基因P4位點不同基因型與薩能奶山羊產(chǎn)奶量的相關(guān)分析Table 3 Relationship between different genotypes of AGPAT6－P4and milk yield in Saanen breed

3 討論

磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）起著調(diào)節(jié)甘油三酯合成過程中的關(guān)鍵作用［7］。對人類的研究表明，AGPAT6基因的超表達(dá)可以增加細(xì)胞中溶血磷脂酸和磷脂酸水平［8－9］。Beigneux等［10］研究顯示，AGPAT6缺陷的小鼠產(chǎn)生的奶中顯著缺少甘油二酯和甘油三酯。在牛上的報道顯示，AGPAT6連同其他基因協(xié)同調(diào)控奶牛乳腺中脂肪酸向乳脂的合成［11－12］。因此，AGPAT6是影響奶成分和奶產(chǎn)量的一個關(guān)鍵基因。

表4 AGPAT6基因P4位點不同基因型與兩個奶山羊品種奶成分的相關(guān)分析Table 4 Relationship between different genotypes of AGPAT6－P4and milk composition in Saanen and Guanzhong dairy goat breeds

張佳蘭等［13］在中國荷斯坦牛AGPAT6基因第2內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)了一個SNP。在該位點不同基因型個體的產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率之間存在顯著差異。昝林森［5］等研究發(fā)現(xiàn)，不同品系的荷斯坦牛乳脂率和奶產(chǎn)量都存在著顯著性差異，其中在AGPAT6基因的第3 內(nèi)含子上檢測到兩個SNPs，它們能顯著影響奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂率。目前的研究還表明，AGPAT6 基因與奶牛的脂肪吸收、合成和沉積和產(chǎn)乳性狀相關(guān)［14］，表明AGPAT6 基因是影響奶牛產(chǎn)奶性狀的候選基因。

本研究中通過對西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊共549只羊的AGPAT6基因全部外顯子和部分5＇UTR 和3＇UTR 進(jìn)行分析，經(jīng)DNA 池測序發(fā)現(xiàn)4個突變位點（P1、P2、P4、P10），在P4 （9263C＞G）NcoI位點上突變與產(chǎn)奶量和乳脂肪及乳蛋白顯著相關(guān)，這與其它的研究結(jié)果相似。Baumgard等［15］研究表明，與乳脂合成相關(guān)的酶包括脂肪酸的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、去飽和以及甘油三酸酯的合成等，這些酶表達(dá)的變化影響乳脂率。其中對AGPAT 家族的研究也說明了這一點，AGPAT2 突變會導(dǎo)致AGPAT2酶活性的降低，以至于引發(fā)先天性脂肪營養(yǎng)障礙［16］。另一項研究顯示，缺失AGPAT6 基因的小鼠泌乳量和乳脂肪含量顯著下降［10］。對牛AGPAT6基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)多個SNPs位點，它們能引起個體間乳脂率、乳蛋白率及乳中干物質(zhì)的顯著差異［5，14］。因此AGPAT6基因可以作為奶山羊分子育種的候選基因。

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