閆云峰，楊 華，楊永林，潘曉亮＊，馬全磊

（1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000；2.新疆農(nóng)墾科學院兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室，新疆石河子832000）

20世紀90年代以來，隨著世界養(yǎng)羊業(yè)結構的調整和重點的轉移，養(yǎng)羊業(yè)由毛用型逐漸轉向肉用型，肉羊業(yè)成為了國內外畜牧業(yè)發(fā)展的重要組成部分。隨著國內人民生活水平日益提高及自我保健意識的逐漸增強，國內羊肉的需求量逐年增加，提高肉羊生產(chǎn)性能和改善肉質已成為肉羊業(yè)發(fā)展的重要目標之一。動物生長軸即GH－IGFs軸是近年來提高動物生長速度及生產(chǎn)性能的研究熱點之一，而GH基因和IGF－1基因是動物生長軸上的重要基因，在動物的生長調控中起著非常重要的作用。顏炳學［1］證明GH基因是控制雞部分屠體性狀的主效基因，趙中權等［2］通過體外擴增證明豬GH基因第四外顯子第1237位點突變與豬的生長密切相關，王寶維等［3］研究發(fā)現(xiàn)IGF－1基因與雞的體重、胸寬及脛長指數(shù)等相關，譚穎［4］證明IGF－1基因顯著影響古藺馬羊的產(chǎn)羔數(shù)。針對綿羊GH和IGF－1 基因表達的研究主要集中在肌內脂肪含量方面［5－6］，皮膚［7］及肝臟［8］而從mRNA 水平研究綿羊GH基因和IGF－1基因在不同組織表達的相關研究有待補充。因此，本研究以肉用性能突出的薩?？烁嵫驗檠芯坎牧?，分析GH基因和IGF－1基因在綿羊不同組織中的表達特征，并初步分析GH基因和IGF－1基因對肉羊生長發(fā)育的作用，探討GH 和IGF－1mRNA的發(fā)育性變化，為研究GH基因和IGF－1基因功能及優(yōu)質肉羊的分子選育提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為新疆農(nóng)墾科學院種羊場3只健康的6月齡薩?？斯?，屠宰后立即采集腸系膜淋巴結、心臟、肝臟、垂體、大腦、腎臟、骨骼肌、體側部皮膚、肺臟、睪丸和脾臟11 個組織，立即置于液氮中速凍，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

2×EasyTaq PCR SuperMix 購自全式金生物技術有限公司，E.Z.N.A.TM Total RNA Kit I購自美國Omega生物技術公司，Primer ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生物工程（大連）有限公司，Light Cycler－Fast Start DNA Master SYBR Green I購自美國Roche公司。Light Cycler 2.0 熒光實時定量PCR 儀（美國Roche公司），Precellys 24 組織勻質器（法國Bertin公司），超微量紫外可見分光光度計（NanoPhotometer，德國Implen公司）。

1.3 引物設計與合成

以3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease，GAPDH）作為內標，根據(jù)楊華等［9］（2009）GAPDH 引物序列進行實時熒光定量PCR。以綿羊IGF－1 mRNA 序列（GenBank登錄號：NM－001009774）和GH mRNA 序列（Gen－Bank登錄號：NM－001009315）設計引物，引物序列見表1，由上海立菲生物技術有限公司合成。

表1 IGF－1、GH 和GAPDH 引物參數(shù)Table 1 Parameters of oligo－nucleotide primer pairs for the IGF－1，GH and GAPDH

1.4 RNA 提取和反轉錄

組織塊0.5 mg經(jīng)Precellys 24 組織勻質器研磨，按照E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit I試劑盒操作說明提取組織總RNA，總RNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用超微量紫外可見分光光度計測定總RNA 濃度和純度。按照Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作說明對總RNA進行反轉錄。

1.4.1 總RNA 中基因組DNA 的去除 1μg 總RNA，2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O 補加至10μL，冰上操作并混勻，隨后42 ℃水浴2min。

1.4.2 cDNA 的合成 上述反應液10μL 中加入1μL Primer Script RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，4μL 5×Primer Script Buffer（for real time），4μL RNase Free dH2O，總體積為20μL?；靹蚝?7 ℃反應15min，85 ℃滅活5s，4 ℃溫育10s。RT 產(chǎn)物保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因的克隆

PCR反應體系為25μL，包括1.5μL cDNA 模板，12.5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上游和下游引物（10μM）各1μL。PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30s，合適的溫度退火30s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，與pMD18－T 載體連接，并轉化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，PCR鑒定，陽性菌落提取質粒，送上海立菲生物技術有限公司測序。用DNAMAN6.0軟件對測序結果進行同源性分析。

1.6 熒光定量PCR

用雙蒸水以10倍梯度連續(xù)稀釋的含目的片段的質粒作為熒光定量PCR 標準品，制作標準曲線。以反轉錄產(chǎn)物為模板，分別用IGF－1，GH和GAPDH基因的引物進行熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR反應體系為20μL：其組成為2μL cDNA，2.4μL Mgcl2（3mM），上游和下游引物（10μM）各1μL，2μL FastStar DNA Master SYBR Green I（10×）。反應程序為：95℃預變性10min；95℃變性10s，合適的溫度退火10s，72 ℃延伸10s，45個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；并進行融解曲線分析。每個組織樣品檢測做3次平行試驗，取其平均值進行計算，并在每批次實驗中設陰性對照，記錄各樣品的Ct值。

1.7 統(tǒng)計分析

樣品設置相同的閾值線，以GAPDH 為內參基因進行標準化，用JMP 4.0（SAS Institute，2000）計算重復樣品間Ct均值以及標準偏差，采用2－△△Ct方法處理數(shù)據(jù)［7］，分析基因相對表達差異量（△Ct＝Ct（目的基因）－Ct（內參基因））；薩?？搜虿煌M織間IGF－1和GH基因的差異表達采用SPSS11.5軟件進行顯著性分析，各組織目的基因表達豐度以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 RNA 提取與RT－PCR 結果分析

總RNA 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示清晰的28S 和18S 條帶；經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260／OD280＝1.8～2.0，提示RNA 完整性和純度較好，可以進行后續(xù)試驗。

2.2 綿羊IGF－1基因和GH 基因克隆測序結果

將GAPDH 基因、IGF－1基因和GH基因擴增片段克隆于pMD18－T 載體，經(jīng)測序證明片段長度分別為149bp、251bp、119bp，目的基因大小與預期一致（圖1－2），用DNAMAM6.0軟件比對分析，證明克隆的基因分別為GAPDH、IGF－1 和GH基因，表明設計的引物能夠正確擴增目的基因，可以用于IGF－1和GH基因的組織表達譜分析。

圖1 GAPDH 基因電泳圖1.空白對照；2～5.GAPDH PCR 產(chǎn)物；M.DL2000Fig.1 The agarose gel electrophoresis of GAPDH1.Negative control；2～5.PCR products of GAPDH；M.DL2000

圖2 GH ＆IGF－1基因電泳圖1，3.空白對照；2；GH PCR產(chǎn)物；4.IGF－1PCR產(chǎn)物；M.DL2000Fig.2 The agarose gel electrophoresis of GH ＆IGF－11，3.Negative control；2.PCR products of GH；4.PCR products of IGF－1；M.DL2000

2.3 擴增產(chǎn)物特異性分析

在SYBR Green I real－time PCR后進行熔解曲線分析，結果見圖3。由圖3 知，IGF－1、GH 以及GAPDH 基因的熔解溫度分別為54 ℃、56 ℃和60℃，PCR 產(chǎn)物均呈一個特異性的峰，陰性對照無擴增產(chǎn)物，表明無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，設計的引物有很好的特異性，目的基因得到較好的擴增。

2.4 綿羊IGF－1和GH 基因組織表達譜分析

圖3 GH、IGF－1、GAPDH 基因熔解曲線Fig.3 The melting curve of GH、IGF－1、GAPDH

綿羊IGF－1和GH基因在11種組織中的相對表達量見圖4。由圖4可以看出，GH和IGF－1基因在綿羊11個組織中均有表達：其中GH基因在脾臟相對表達量最高，為1.12，其次是淋巴結和睪丸，三者的表達量差異未達到顯著性水平（P＞0.05）；GH基因在脾臟、淋巴結、睪丸中的相對表達量顯著高于心臟、肝臟、腎臟、大腦和骨骼?。≒＜0.05）；骨骼肌相對表達量最低，與肺臟中的表達量也存在顯著差異（P＜0.05）。IGF－1基因在肝臟相對表達量為7.99，表達豐度最高，淋巴結次之，而在骨骼肌中相對表達量最低，僅為0.12；IGF－1 基因在肝臟和淋巴結中的表達量顯著高于骨骼肌、大腦、腎臟、心臟、垂體、皮膚、肺臟、脾臟和睪丸9 個組織（P＜0.05），但在肝臟和淋巴結中的表達量差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 IGF－1基因和GH 基因相對表達量Fig.4 IGF－1and GH gene relative expression

3 討論

動物生長是一個極其復雜、高度綜合的過程，不僅受神經(jīng)內分泌調控，同時也受到營養(yǎng)水平、環(huán)境及基因型等多種因素的影響。一般認為GH－IGFs軸對動物生長發(fā)育有重要作用，GH－IGFs生長軸中，GH 先與其受體結合形成配體受體復合物，激發(fā)一系列生物反應使GH基因表達，繼而再通過信號傳遞到IGF－1，然后促進IGF－1基因的表達，從而調控IGF－1的合成和釋放，同時IGF－1則反饋抑制GH釋放。通過這種反饋調節(jié)［11］或者存在一種自我調節(jié)機制［12］甚至是個體發(fā)育調節(jié)、內分泌因子調節(jié)及營養(yǎng)調節(jié)［13］，兩者能夠在機體內保持一個合理的濃度水平或表達豐度，最終維持機體正常的生長和生理反應。

總體看來，GH基因與IGF－1基因在綿羊各組織中兩者的表達存在差異，GH基因不僅在薩?？搜虻钠⑴K、淋巴結及睪丸中高表達，而且在其他組織器官也普遍表達，進一步說明GH基因對免疫系統(tǒng)、繁殖性能、生長發(fā)育等均起生物學作用，具有一因多效作用。IGF－1基因主要在肝臟高表達，淋巴結、脾臟等次之，這與Ichikawa等［10］的研究結果相似，說明IGF－1 基因對免疫系統(tǒng)、肝臟細胞生長等都有重要作用，也具有一因多效作用。說明肝臟不僅是該生長因子的主要合成器官，也是該基因特異性表達的組織器官之一。

由于動物機體不同組織中存在不同類型的GHR／IGF－1R 受體，不同組織中GHR 和IGF－1R表達量不同，甚至在不同組織中不同類型的GHR和IGF－1RmRNA 表達量也不同。Liu等［14］研究表明，豬肝臟中有1A 和1B2 種GHR mRNA，而肌肉、懷孕母豬卵巢及子宮只有1B 型GHR mRNA。Jiang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，牛除了1A 和1B類型外，還存在GHR－1C、GHR－1D、GHR－1E、GHR－1F、GHR－1G、GHR－1H 和GHR－1I等7 種形式GHR mRNA。本試驗利用熒光定量PCR SYBR Green I熒光染料法檢測綿羊心臟、肝臟、腸系膜淋巴結等11個組織GH基因和IGF－1基因表達水平，證明GH基因和IGF－1 基因在睪丸、脾臟、肝臟、皮膚等11個各組織中均有表達，GH基因在綿羊脾臟、睪丸、皮膚、淋巴中高度表達，垂體、腎臟、大腦中中豐度表達，其余組織中低豐度表達；IGF－1基因在肝臟相對表達量較高，腎臟、大腦、垂體、肌肉、皮膚相對表達量較低，說明不同組織中不同類型的GHR 和IGF－1RmRNA 表達量影響GH和IGF－1基因的組織特異性表達。石子剛［16］報道GH基因參與脾臟發(fā)育及其功能的調節(jié)，本研究也證明GH基因在脾臟表達量較高，由于淋巴、脾臟均屬于免疫器官，推測GH基因對免疫功能的改善有積極的作用。李發(fā)弟［13］研究表明GH 對動物初情期的啟動、性成熟及精子發(fā)生和成熟有調節(jié)作用，本研究證明薩?？烁嵫虿G丸中GH 表達量較高，提示GH 可能參與了睪酮的合成調節(jié)。同時，GH基因在肺臟中也有較高豐度，提示GH基因與呼吸系統(tǒng)的發(fā)育有關。IGF－1基因在脾臟和肝臟中表達豐度較高，提示IGF－1同樣參與綿羊脾臟的免疫調節(jié)，另外，Mateescu等［17］報道睪酮經(jīng)IGF－1基因作用影響綿羊肌肉生長，推測該基因在生殖系統(tǒng)的的網(wǎng)絡調控中發(fā)揮一定作用。相關研究表明，在妊娠早期和中期，胎盤中IGF－1基因表達變化會對妊娠后期胎兒發(fā)育產(chǎn)生影響［18］，不同日齡綿羊的GH和IGF－1 mRNA 水平存在差異［7，17］。

動物在不同生長階段靶器官受體表達也存在差異［19－20］，動物飼喂不同類型的日糧能激活胰島素信號通路與JAK2－STAT 通路中部分重要基因表達，導致基因的表達也隨之而改變［11］，遺甚日糧營養(yǎng)水平不同，基因的表達豐度也有差異［8］。因此，不同組織器官、不同生長階段、受體類型、品種、年齡及性別都會影響GH和IGF－1基因的組織特異性表達。

4 結論

GH基因在睪丸、腸系膜淋巴結和脾臟中呈高豐度表達；IGF－1基因在肝臟和腸系膜淋巴結中呈高豐度表達，GH和IGF－1基因存在組織表達的特異性和差異性。

GH基因在薩?？搜蛏L發(fā)育、免疫和繁殖性能中起作用，IGF－1基因也對薩福克羊生長發(fā)育及免疫發(fā)揮效應，GH和IGF－1基因均具有一因多效作用。

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