喬立君，鄭 征，馬文慧，蘆庭秀，蓋曉英，葛銀林

多不飽和脂肪酸對大鼠腸道菌群及脂肪代謝相關基因的影響

喬立君，鄭 征，馬文慧，蘆庭秀，蓋曉英，葛銀林*

（青島大學醫(yī)學院，生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021）

目的：研究多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fat acids，PUFA）飲食對大鼠腸道菌群及相關脂肪因子的影響，探討其作用機理。方法：將30 只5 周齡健康大鼠分為正常對照組、n-6 PUFA組和n-3 PUFA組，自由攝食飲水8 周，每周記錄大鼠體質量，實驗結束時取大鼠盲腸糞便和肝臟，用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測雙歧桿菌（Bifi dobacterium，Bif）、乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）、腸道細菌Akkermansia muciniphila（Akk）和脂肪因子脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、禁食誘導脂肪因子（fasting-induced adipose factor，F(xiàn)IAF）的水平；并將大鼠盲腸石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色測量其黏膜厚度。結果：n-3 PUFA組與正常對照組相比，肥胖程度和FAS水平明顯降低（P＜0.05），Bif、Lac、Akk和FIAF水平明顯升高（P＜0.05），腸道黏膜厚度明顯增加；n-6 PUFA組大鼠的各項指標和正常對照組相比均無統(tǒng)計學差異。結論：n-3 PUFA飲食與n-6 PUFA飲食相比，可改變腸道菌群，抑制肥胖的發(fā)生和發(fā)展。

n-3多不飽和脂肪酸；肥胖；Akkermansia muciniphila；腸道黏膜

肥胖是指一定程度的明顯超重與脂肪層過厚，是體內脂肪，尤其是甘油三酯積聚過多而導致的一種狀態(tài)。由于食物攝入過多或機體代謝的改變而導致體內脂肪積聚過多，造成體質量過度增長并引起人體病理、生理改變或潛伏。歷年來，肥胖一直是人們急需解決的問題。有不少研究證明，魚油中的n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fat acids，PUFA）可對脂肪因子產(chǎn)生影響，有一定的減肥作用。n-3 PUFA，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）具有很強的生理活性，對人和動物的多種疾病，如癌癥等具有特殊的預防和治療效果，是一種重要的免疫調理性營養(yǎng)素。n-3 PUFA作為 一種特殊的腸內營養(yǎng)素，可以減輕腸道黏膜損傷，促進腸道炎癥愈合，對腸道具有保護作用，但關于其對腸道微生態(tài)影響方面的文獻報道并不多。本實驗通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantity real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法，觀察n-3 PUFA對實驗組大鼠腸道菌群和脂肪因子的影響，探討魚油對大鼠腸道生物屏障的影響，為n-3 PUFA作為防治腸道相關疾病的營養(yǎng)素提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級Wistar雌性大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

標準實驗動物飼料 濟南康大飼料有限公司；脫脂甜奶粉 瑞士雀巢公司；脫脂大豆粉 青島美辰食品公司；深海魚油 美國康隆公司；維生素A、D膠丸青島雙鯨藥業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

各組飼料配方參照本實驗室飼料制備配比見表1，飼料制備后4 ℃低溫保存。

表1 各組飼料成分配方Table 1 Ingredients of rat diets

1.2 儀器與設備

DW-86L626超低溫冰箱、BCD-196TE冰箱 青島海爾公司；SIGMA 1-13離心機 美國Sigma公司；PYXDHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；RG-3000熒光定量PCR儀 英國Corbett Research公司；RM2235切片機 德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和實驗設計

30 只SPF級5 周齡雌性Wistar大鼠，體質量100～120 g，隨機分為正常對照組、n-3 PUFA組和n-6 PUFA組。正常對照組體質量為（116.40±0.10）g；n-3 PUFA組體質量為（109.33±0.28）g；n-6 PUFA組體質量為（115.62±0.52）g。每組分為3 籠，自由攝食飲水。實驗動物房溫度（22±5）℃，相對濕度（50±10）%，明暗周期12 h/12 h。每周記錄每只大鼠的體質量。第8周末時注射質量分數(shù)為10%的水合氯醛，處死大鼠，記錄每只大鼠肛門到鼻尖的長度作為體長，無菌條件下取大鼠腸道糞便分裝于滅菌的5 mL離心管中，于-70 ℃保存。取大鼠肝臟于-70 ℃保存，取大鼠回腸、結腸、盲腸浸入體積分數(shù)為10%的甲醛固定24 h，進行石蠟包埋、切片，以備蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3.2 糞便樣品的處理及腸道細菌總DNA的提取

糞便樣品處理參照參考文獻[1]。處理好的樣品于-20 ℃保存。

腸道細菌總DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取，具體步驟參照參考文獻[2]。提取的DNA于-20 ℃保存。

1.3.3 肝臟總RNA提取

稱取50～100 mg肝臟組織，用Trizol（TaKaRa）提取，按試劑盒步驟進行。提取的總mRNA用Roche反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。

1.3.4 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物

雙歧桿菌（Bifidobacterium，Bif）、乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）引物參照參考文獻[3]，腸道細菌Akkermansia muciniphila（Akk）引物參照參考文獻[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；禁食誘導脂肪因子（fasting-induced adipose factor，F(xiàn)IAF）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，見表2。

表2 各引物序列Table 2 Sequence of primers used in this study

1.3.5 實時定量PCR

腸道菌群的實時定量PCR。25 μL反應體系包括：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Roche），200 nmol/L引物，1 μL DNA樣品。Bif、Lac反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，Akk退火溫度為60 ℃。每個樣本重復3 次，以2-ΔΔCt表示樣本中mRNA的相對表達量。

以提取的DNA樣本為模板，用各基因的特殊引物（表2）進行普通PCR，得到PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后與T載體連接，構建質粒轉化大腸桿菌。質粒用DNA提取試劑盒提取后作為qRT-PCR的對照。

脂肪基因的實時定量PCR。25 μL反應體系包括：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Roche），200 nmol/L引物，500 ng RNA樣品。反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，每個樣本重復2 次，以2ΔΔ-Ct表示樣本中mRNA的相對表達量。

1.3.6 HE染色測量腸道黏膜厚度

取近結腸處約1 cm長，固定在體積分數(shù)為10%的甲醛溶液中24 h后，用磷酸鹽緩沖液清洗24 h，分別浸入55%、65%、75%、85%、95%、100%乙醇中脫水，再放入二甲苯中，之后浸蠟包埋，切片進行HE染色。每個部位最少測量與黏液層垂直的20 個厚度值，隨機選取每個結腸的5 個部位，用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 6.3）測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結果以x±s表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對每周體質量增加量、體質量/體長等作統(tǒng)計學分析，用t檢驗進行各組間的兩兩比較。顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 體質量、體長的測定結果

圖1 3 組大鼠每周體質量平均增加量和體質量/體長Fig.1 Comparisons of average body weight and weight/length ratio between rats fed high fat diet and those fed n-3 or n-6 PUFA-containing diet or common diet

由圖1可知， 3 組大鼠的每周體質量增加量的平均值（F=5.374，P=0.013＜0.05）差異有統(tǒng)計學意義；n-3 PUFA組大鼠的每周體質量增加量的平均值顯著低于正常對照組（P＜0.05）；n-3 PUFA組的體質量/體長值增加趨勢緩慢。n-6 PUFA組和正常對照組之間無顯著性差異。表明n-3 PUFA組大鼠的肥胖程度顯著低于另外兩組。

2.2 實時定量結果

2.2.1 腸道菌群結果

圖2 3 組大鼠種腸道菌群的變化Fig.2 Changes in gut microbiota between rats fed high fat diet and those fed n-3 or n-6 PUFA-containing diet or common diet

由圖2可知，n-3 P U FA組和正常對照組相比，Bif、Lac和Akk均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.229，P=0.047 6＜0.05；t=2.653，P=0.021 0＜0.05；t=1.680，P=0.001 3＜0.05）；而n-6 PUFA組的Bif雖也有所增加，但與正常對照組相比，二者之間仍無顯著性差異（P=0.099 6）；n-6 PUFA組中Akk變化量低于正常對照組，但沒有統(tǒng)計學意義（P=0.121 2）。

2.2.2 肝臟脂肪代謝相關基因結果

圖3 肝臟中2 種脂肪因子的變化Fig.3 Changes in liver adi pocytokines

由圖3可知，3 個組FAS mRNA和FIAF mRNA之間的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=4.391，P=0.023 7＜0.05；F=4.094，P=0.029 5＜0.05）；n- 3PUFA組FIAF與正常對照組相比表達量增加（P=0.040 3＜0.05），與n-6 PUFA組相比無顯著性差異（P=0.0572）；n-3 PUFA組FAS表達量減少與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041 1＜0.05）；而n-6 PUFA組FAS表達量增加，和正常對照組相比有顯著性差異（P=0.010 3＜0.05）。

2.3 腸道黏膜厚度

由圖4可知，在100×顯微鏡下獲取圖片，用圖像分析儀測量各組結腸腸道黏膜的厚度，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.10，P＜0. 01）；n-3 PUFA組與正常對照組相比厚度增加（P=0.003 4＜0.05）；而n-6 PUFA組和正常對照組之間無顯著性差異（P=0.056 0）。

圖4 3 組腸道黏膜厚度的比較Fig.4 Comparison of intestinal mucus thickness among three groups

3 討 論

近年來，n-3 PUFA對健康的影響越來越受到人們的重 視。n-3 PUFA是一類重要的多不飽和脂肪酸，主要包括EPA、DHA、二十二碳五烯酸、二十碳四烯酸、α-亞麻酸（alpha-linolenic acid，ALA）。其中EPA和DHA的營養(yǎng)保健作用最有效。攝入一定量的EPA和DHA可以降低肥胖成年人體內的脂肪含量，促進脂肪的利用[5]；增強2型糖尿病患者體內胰島素的敏感性，緩解胰島素抵抗性[6]，顯著降低糖尿病患者血清甘油三酯和血脂水平[7]。本實驗中，長期給大鼠喂食添加n-3 PUFA的食物后，可有效地控制其肥胖的發(fā)生，降低其肥胖程度，說明EPA和DHA對大鼠有減肥作用，該結果與相關報道一致[5]。

腸道菌群結構對維持腸道內環(huán)境平衡起著非常重要的作用，人體是否健康與腸道內的益生菌群結構息息相關，因此，人體在正常情況下，菌群結構相對穩(wěn)定，對宿主表現(xiàn)為不致病。相反，如果腸道菌群失調，會引起各種疾病。有研究指出，有益菌的比例在體格強健的人腸道內達到70%，普通人則是25%，便秘人群減少到15%，而在癌癥病人腸道內的比例只有10%。近年來，隨著相關研究論文的發(fā)表，腸道菌群與腸道內環(huán)境平衡和疾病的關系逐步清晰。有證據(jù)表明，腸道菌群可以調控脂肪代謝、引發(fā)低度慢性炎癥[8]和破壞腸道屏障[9-11]，可以導致胰島素抵抗和肥胖癥的發(fā)生[12-13]。腸道菌群對腸黏膜系統(tǒng)的機械屏障、免疫屏障與生物屏障有調控作用。腸道中的大腸桿菌可以通過上調緊密連接蛋白ZO-1的表達，減輕腸上皮的通透性[14]。乳酸桿菌可以對病原菌的定殖產(chǎn)生阻抗作用[15]，能較好地恢復小鼠的腸黏膜免疫屏障功能[16]。雙歧桿菌可以有效減少乳糜瀉患者中由小麥醇溶蛋白引起的結腸上皮細胞的細胞膜皺褶[17]，從而調控腸道的機械屏障。腸道菌群會隨著飲食的變化而變化，研究表明，飲食是決定腸道菌群構成的最重要因素。因此，通過改變飲食，可以讓引起肥胖、糖尿病[18]、冠心病[19]的菌群結構恢復正常，從而為預防、緩解甚至逆轉這些疾病帶來新的希望。本實驗中，通過檢測n-3、n-6 PUFA對大鼠腸道菌群的影響發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFA可以增加腸道內一些益生菌如Bif、Lac、Akk的含量，從而影響大鼠腸道內 的菌群環(huán)境，改善大鼠的體內微環(huán)境，調控腸道的屏障功能。

Akk是一種革蘭氏陰性菌，是疣微菌門的一種。近日，Akk被確定為駐留在黏液層的黏蛋白降解細菌，并且它在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中的人類細菌中占主導地位[20]。最新研究表明，Akk是一種減肥細菌，益生元（低聚果糖）能促進其在腸 道內的豐富度。它通過增加腸道黏膜的厚度來提高腸道黏膜屏障功能，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)和提高脂肪組織代謝。在飲食誘導的肥胖小鼠中Akk能改善代謝混亂，增加回腸中內源性大麻素的水平，抵消肥胖中飲食引起的結腸黏膜屏障的功能紊亂[18]。在本實驗中，n-3 PUFA組大鼠的腸道黏膜厚度顯著高于另外2 組，這可能與腸道菌群Akk的含量有關。進一步說明，n-3 PUFA可能通過改善腸道菌群，增加黏膜厚度，來提高腸道黏膜屏障功能。

FAS是脂肪酸合成的主要限制酶，它在乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A從頭合成長鏈脂肪酸的過程中起催化作用。有研究指出，n-3 PUFA不僅能在蛋白水平抑制FAS的活性[21]，而且還能在轉錄水平抑制FAS基因的表達[22-23]。另外，相關研究表明，腸道菌群作為內化了的環(huán)境因子，可以直接調控動物的基因表達，它們可以增強肝臟合成脂肪的基因FAS的活性，同時關閉腸道內抑制脂肪積累的基因FIAF[24]。FIAF也稱為血管生成素樣蛋白4，是過氧化物酶體增殖物激活受體的新靶點[25]，是一種新的下丘腦調節(jié)器，它可以調節(jié)食物的攝取，從而影響體質量[26]。本實驗中，n-3 PUFA組FAS表達量減少，F(xiàn)IAF表達量增加，可能一方面通過n-3 PUFA直接影響基因的轉錄，另一方面可能通過n-3 PUFA影響腸道菌群的量來間接影響基因的合成。這說明n-3 PUFA可能從多方面影響基因合成，從而達到減肥的目的。

綜上所述，本實驗討論了n-3 PUFA對腸道菌群的影響及其對肥胖的抑制作用的可能途徑。這些結果提示n-3 PUFA可能通過改變腸道菌群中的有益菌，特別是Akk，改善腸道微環(huán)境，增加腸黏膜厚度，提高腸道黏膜屏障功能，并通過控制脂肪代謝相關基因的表達來達到減肥的目的。同時，為人類使用這種腸道細菌用于預防或治療肥胖癥和其相關的代謝紊亂提供了新的治療方法。

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Effect of PUFA-Containing Diet on Gut Microbiota and Fat Metabolism-Related Genes in Rats

QIAO Li-jun, ZHENG Zheng, MA Wen-hui, LU Ting-xiu, GAI Xiao-ying, GE Yin-lin*
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medical, Qingdao University, Qingdao 266021, China)

Purpose: To determine the effect of PUFA diet on gut microbiota and obesity-related cell factors in rats. Me thods: A total of 30 five-week-old healthy female rats were randomly divided into three groups: control group, n-6 PUFA-containing diet group and n-3 PUFA-containing diet group. The rats had free access to the feeds and water for eight weeks. Body weight was recorded once a week during the trail period and the levels of Bifi dobacterium (Bif), Lactobacillus (Lac), Akkermansia muciniphila (Akk) and obesity-related cell factors, fatty acid synthetase (FAS) and fasting-induced adipose factor (FIAF) were evaluated by qRT-PCR at the end of the trial. Results: The adiposity and FAS level in the n-3 PUFA-containing diet group were significantly lower than that in the control group (P ＜ 0.05), and the levels of Bif, Lac, Akk and FIAF, and the thickness of the intestinal mucosa in the n-3 PUFA-containing diet model group were significantly higher than those in the control group (P ＜ 0.05). Conclusion: An obvious change in gut microbiota was observed in rats fed n-3 PUFA-containing diet; meanwhile the occurrence and development of adiposity were inhibited.

n-3 PUFA; obesity; Akkermansia muciniphila; intestinal mucosa

R378

A

1002-6630（2014）17-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201417044

2013-10-12

山東省自然科學基金項目（ZR2010CM010）

喬立君 （1988—），女，碩士研究生，研究方向為基因治療。E-mail：qlj19880728@163.com

*通信作者：葛銀林（1957—），男，教授，博士，研究方向為基因診斷與治療。E-mail：geyinlin@126.com