楊吉霞，陳芝蘭，賀稚非,*，陳宗道

牦牛奶酪中乳酸菌對抗生素的藥敏性

楊吉霞1，陳芝蘭2，賀稚非1,*，陳宗道1

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，重慶 400715；2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院科研處生物中心，西藏 林芝 860000）

分析牦牛奶酪中乳酸菌對常用抗生素的藥敏性。采用紙片擴散法測定分離自牦牛奶酪的39 株乳酸菌對8 種常用抗生素的藥敏性。結(jié)果表明：39 株乳酸菌都有耐藥性，主要對萬古霉素、新霉素、鏈霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分別達到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38株（97.4%）和39株（100%），菌株的耐藥性有一定的種間差異，部分菌株有多重耐藥性。

牦牛奶酪；乳酸菌；抗生素；耐藥性

乳酸菌在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用主要有兩個方面，一是發(fā)酵微生物，在發(fā)酵制作乳制品、肉制品、泡菜的過程中起著關(guān)鍵的作用，另一方面是作為益生菌，可定植于動物腸道中，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫、降低血清膽固醇等益生功能[1-2]，從天然乳酸菌中發(fā)掘出了有優(yōu)良益生功能的菌株，制作成含菌飲料、發(fā)酵乳制品、腸道微生態(tài)制劑等保健或者健康食品，有益生功能的乳酸菌也被廣泛應(yīng)用于飼料中，對于畜禽的日常保健有顯著的功效[3]。

1980年國外學(xué)者研究了乳酸菌的藥敏性[4-5]，發(fā)現(xiàn)它們對抗生素有耐藥現(xiàn)象。乳酸菌作為益生菌，它的耐藥性有兩方面的意義，一方面是積極的意義，當(dāng)人或動物服用抗生素時，往往會把腸道中有益和有害的細菌同時殺滅，引起腹瀉，如果乳酸菌對抗生素有抗性，就可以緩解這種不良反應(yīng)，幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[6-7]，在動物飼料中，也常選用有耐藥性的菌株，與抗生素配伍使用，在促進動物體內(nèi)正常菌群的建立、提高畜禽生產(chǎn)能力方面起到協(xié)同增效的作用[8]。另一方面是負面的意義，乳酸菌以活菌的形式進入人或動物體內(nèi)，在腸道內(nèi)定殖，如果它攜帶耐藥基因片段，而且位于質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子上，耐藥基因片斷就有可能通過水平轉(zhuǎn)移傳遞給腸道中的致病菌，導(dǎo)致致病菌獲得耐藥性[9]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌也有可能將耐藥基因片段傳遞給環(huán)境中的致病菌，使致病菌獲得耐藥性。

乳酸菌的食用歷史長達數(shù)千年，安全性是公認的，被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認定為“一般公認安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物[1]。國外學(xué)者對乳酸菌耐藥性和相關(guān)基因進行了一系列的研究，提出耐藥性問題是乳酸菌在應(yīng)用安全方面的首要問題[10]。我國對乳酸菌藥敏性研究工作相對較少，馮大偉[11]、徐進[12]、李平蘭[13]等研究了益生乳酸菌的藥敏性，凡琴[14]、周林[15]、魏新元[16]等研究了酸奶中的乳酸菌的藥敏性，馬艷[17]和甄麗[18]等研究了飼料乳酸菌的藥敏性。大部分研究主要集中于工業(yè)菌株，而對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的天然乳酸菌報道很少，胡勇[19]研究了青海部分酸奶中乳桿菌的藥敏性。我國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中蘊藏著種類豐富的乳酸菌，是潛在的益生菌株和工業(yè)發(fā)酵菌株的重要來源，研究它們對常用抗生素的藥敏性，對于它們在益生或者發(fā)酵方向的應(yīng)用有重要的參考價值。

紙片擴散法是分析乳酸菌藥敏性最基本的方法，對實驗條件要求低、操作簡單，但是至今仍然沒有標準的實驗方法，主要是培養(yǎng)基和評判標準不統(tǒng)一。本研究總結(jié)了國內(nèi)外紙片擴散法的實驗方法，分析分離自牦牛奶酪的39 株乳酸菌對8 種常用抗生素的抗性，以期為它們在益生或者發(fā)酵方向的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試菌株為分離自牦牛奶酪的39 株乳酸菌，菌株編號為1～39，數(shù)字前用字母表示采樣地點，T（西藏），Y（云南），X（新疆），如表1所示，它們的分離鑒定已在另一篇論文中報道[20]。采用金黃色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923 作為質(zhì)控菌株。1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

表1 供試菌株16S rRNA序列鑒定結(jié)果Table 1 Species identification of the strains isolated from yak milk cheese by 16S rRNA sequence analysis

氨芐青霉素鈉鹽、氯霉素、紅霉素、新霉素硫酸鹽、萘啶酮酸、鏈霉素硫酸鹽、四環(huán)素鹽酸鹽、萬古霉素鹽酸鹽 北京拜爾迪生物公司；麥氏比濁管（McFarland） 生物梅里埃中國有限公司；MRS培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)公司。

1.1.3 藥敏紙片的制備

用濾紙片制成直徑為7 mm的圓形紙片，讓紙片完全吸附不同效價的抗生素，分別為氨芐青霉素（ampicillin，Am，10 μg）、氯霉素（chloramphenicol，C，30 μg）、紅霉素（erythromycin，E，15 μg）、新霉素（neomycin，N，30 μg）、萘啶酮酸（nalidixic acid，NA，30 μg）、鏈霉素（streptomycin，S，10 μg）、四環(huán)素（tetracycline，TE，30 μg）、萬古霉素（vancomycin，VA，30 μg），劑量參照美國臨床實驗室標準化研究所（Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI/NCCLS）2012版的規(guī)定[21]。

1.2 方法[21-22]

用MRS液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接菌株兩次，得到活化的菌株。在9 cm培養(yǎng)皿中倒入15 mL MRS瓊脂培養(yǎng)基，取200 μL活化菌液（混濁度相當(dāng)于1 McFarland，即3.0×108CFU/mL）（加入4 mL 軟瓊脂（0.6%瓊脂，45 ℃）混勻，此時軟瓊脂中活細胞濃度控制在1.5×107CFU/mL，將軟瓊脂均勻地鋪在MRS固體培養(yǎng)基上，于室溫下放置大約15 min，待上層瓊脂冷卻凝固并適當(dāng)干燥，然后將含有抗生素的藥片用無菌操作貼放在瓊脂表面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用尺子測抑菌圈直徑，讀數(shù)至毫米，取6 次測量的平均值作為結(jié)果。質(zhì)控菌株S. aureus ATCC 25923的培養(yǎng)和保藏用TSB培養(yǎng)基，藥敏性實驗用MRS培養(yǎng)基，用來監(jiān)控實驗的精確性和準確性。每個實驗重復(fù)3 次。

供試菌株對8 種抗生素的藥敏性判斷標準參照文獻[22]，列于表2中。

表2 抗生素抗性的判斷標準Table 2 Standards for judgment antibiotic resistance

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控菌株的耐藥性實驗

質(zhì)控菌株S. aureus ATCC 25923的耐藥性實驗如圖1所示，抑菌圈直徑如表3所示。一般用MH培養(yǎng)基測質(zhì)控菌株的藥敏性，本實驗測出該菌株在MRS培養(yǎng)基上也能生長，抑菌圈直徑都在有效范圍之內(nèi)，說明質(zhì)控菌株和待測菌株可以統(tǒng)一采用MRS培養(yǎng)基，抗生素都是有效的，實驗方法的建立是正確的。

圖1 質(zhì)控菌株S. aureus ATCC 25923的耐藥性實驗照片F(xiàn)ig.1 Photographs showing antibiotic resistance of reference strain S. aureus ATCC 25923

表3 質(zhì)控菌株S. aureus ATCC 25923的耐藥性Table 3 Antibiotic resistance of reference strain S. aureus ATCC 25923

表4 乳酸菌對抗生素的抗性Table 4 Antibiotic resistant patterns of the isolated lactic acid bacteria

2.2 待測菌株的耐藥性實驗

本研究總結(jié)了國內(nèi)外文獻中分析乳酸菌耐藥性所用的紙片擴散法，主要有以下幾個要點：1）培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（pH 6.8）適合于乳桿菌培養(yǎng)，被廣泛用于乳桿菌的藥敏測試。2）菌液濃度：本研究將菌液濃度控制在1.5×107CFU/mL，平行實驗抑菌圈直徑穩(wěn)定。3）接種方式采用傾注法，平行實驗抑菌圈直徑穩(wěn)定。4）評判標準：國內(nèi)外文獻對乳酸菌的藥敏性沒有明確的判斷標準，Charteris等[22]提供了44 種抗生素敏感、中度敏感和抗性的抑菌圈直徑范圍，被廣泛引用。

由表4可知，從菌種的角度來分析，本研究中的39 株乳酸菌分別屬于9 個菌種：L. buchneri，L. casei，L. diolivorans，L. fermentum，L. helveticus，L. kefiri，L. plantarum，P. acidilactici，P. pentosaceus，乳酸菌的耐藥性表現(xiàn)出一定的種間差異。例如，僅有3 株菌對萬古霉素敏感，而這3 株菌都是L. helveticus。對于新霉素敏感的菌株只有7 株，L. diolivorans的3 株菌1 株敏感2 株中度敏感，相對于其他菌種來說有較強的敏感性。對于四環(huán)素敏感的菌株有17 株中度敏感7 株，L. casei的16 株菌中有15 株敏感1 株中度敏感，相對于其他菌種來說有很強的敏感性，而L. diolivorans的3 株菌都對四環(huán)素有抗性。Danielsen等[23]指出，乳酸菌的耐藥性存在屬間或者種間的差異，有必要將藥敏實驗數(shù)據(jù)與乳酸菌的菌種結(jié)合起來分析，更能夠解析乳酸菌的藥敏性。

本研究中的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，21 株菌的耐藥譜為“萬古霉素-新霉素-鏈霉素-萘啶酮酸”，占總菌株數(shù)的53.8%，6 株菌的耐藥譜為“萬古霉素-鏈霉素-四環(huán)素-萘啶酮酸”，占總菌株數(shù)的15.4%，4 株菌的耐藥譜為“萬古霉素-新霉素-鏈霉素-四環(huán)素-萘啶酮酸”，占總菌株數(shù)的10.3%。菌株T4對8 種抗生素都有抗性，是耐藥譜最廣的菌株，其次是T5，對7 種抗生素有抗性，T7、Y13和Y18對6 種抗生素有抗性。

表5 乳酸菌對8 種抗生素的敏感性統(tǒng)計數(shù)據(jù)Table 5 Statistical data for the susceptibility of the 39 lactic acid bacterial strains to 8 antibiotics

由表5可知，從抗生素的角度分析，39 株乳酸菌主要對萬古霉素、新霉素、鏈霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分別達到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38 株（97.4%）和39 株（100%）。已有較多的文獻報道了乳酸菌對萬古霉素的抗性，例如，Hamilton-Miller[24]和Simpson[25]等報道了Lactobacilli、Pediococci和Leuconostoc spp.對萬古霉素有天然的抗性，Elisha等[26]報道了L. plantarum、L. casei、L. salivarius、L. leishmannii和L.acidophilus由于體內(nèi)有D-丙氨酸和D-丙氨酸連接酶，對萬古霉素有天然的抗性。Danielsen等[23]報道了一些乳桿菌對鏈霉素有天然的抗性，Curragh等[27]也指出一些乳桿菌對鏈霉素有很高的自發(fā)突變頻率，表現(xiàn)出耐藥性。本研究測出39 株乳酸菌對萬古霉素和鏈霉素有普遍的耐藥性，與這些報道是一致的。乳酸菌對新霉素和萘啶酮酸藥敏性研究報道比較少。

乳酸菌的耐藥性有兩種情況：一種是先天固有的耐藥性，被認為是種的特性，其耐藥基因片段通常隨著菌株的繁殖遺傳給下一代（垂直轉(zhuǎn)移），不會轉(zhuǎn)移給致病菌。另一種是獲得性耐藥性，其抗性基因片段有可能通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式轉(zhuǎn)移給其他菌株（水平轉(zhuǎn)移），這種耐藥性有可能通過水平轉(zhuǎn)移傳遞給致病菌[9,28]。乳酸菌對萬古霉素、鏈霉素和萘啶酮酸的耐藥性是先天固有的，一般不會轉(zhuǎn)移[9]。已有研究證明，一些乳桿菌如干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌對萬古霉素先天具有抗性，它們作為安全的益生菌使用已有多年的歷史，沒有發(fā)現(xiàn)抗萬古霉素的特性轉(zhuǎn)移給其他細菌，所以認為不必擔(dān)心其安全性[29]。而本研究中乳酸菌對于新霉素普遍有抗性，這是比較值得注意的，需要檢測抗生素抗性基因片段是否位于質(zhì)粒上，進而判斷這些菌株是否安全，是否可以作為人和動物的益生菌。

3 結(jié) 論

本研究采用分離自牦牛奶酪的39 株乳酸菌（分別屬于9 個菌種）作為供試菌株，測試它們對8種常用抗生素的藥敏性。研究結(jié)果表明39 株乳酸菌都有耐藥性，主要對萬古霉素、新霉素、鏈霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分別達到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38 株（97.4%）和39 株（100%），菌株的耐藥性有一定的種間差異，部分菌株有多重耐藥性。本研究的結(jié)果為這些乳酸菌在益生或者發(fā)酵方向的應(yīng)用提供了參考數(shù)據(jù)。

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Antibiotic Susceptibility of Lactic Acid Bacteria Isolated from Yak Milk Cheese

YANG Ji-xia1, CHEN Zhi-lan2, HE Zhi-fei1,*, CHEN Zong-dao1
(1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Center of Biology, Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University, Linzhi 860000, China)

Objective: The antibiotic susceptibility of 39 lactic acid bacterial strains isolated from yak milk cheese was evaluated in this study. Methods: Disc diffusion method was employed to test antibiotic susceptibility of these isolates to eight most widely used antibiotics, including ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, neomycin, nalidixic acid, streptomycin, tetracycline and vancomycin. Results: These strains primarily presented resistance to four antimicrobial agents: vancomycin, neomycin, streptomycin and nalidixic acid. The number of resistant strains was 36 (92.3%), 32 (82.1%), 38 (97.4%) and 39 (100%), respectively. There was variation in susceptibility between the species. Multidrug resistance was identified in most isolates. Conclusion: This study provides valuable data on these isolates for the consideration of application as probiotic bacteria or fermentation starters.

yak milk cheese; lactic acid bacteria; antibiotics; resistance

TS252.54

A

1002-6630（2014）17-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201417034

2013-08-21

楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yangjx@188.com

*通信作者：賀稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物學(xué)。E-mail：zfhe2003@yahoo.com.cn