張 南，袁曉梅，楊 洋，楊 爽，郭 敏，郭悅鵬

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100;2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

免疫—炎癥機(jī)制是當(dāng)前支氣管哮喘的主流發(fā)病學(xué)說(shuō)之一［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，輔助性 T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)及相關(guān)細(xì)胞因子在支氣管哮喘氣道炎癥和氣道重塑的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。孟魯司特作為一種強(qiáng)效選擇性半胱氨酰白三烯1受體(CysLT1Rs)拮抗劑，是支氣管哮喘治療的一線用藥，已被列入國(guó)內(nèi)外哮喘防治指南［2］。我們于2013年5～9月觀察了孟魯司特對(duì)慢性支氣管哮喘大鼠模型Th17細(xì)胞分化的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量140～150 g(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。雞卵清蛋白(OVA，GradeⅡ，美國(guó)Sigma公司);氫氧化鋁(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);孟魯司特鈉片(10 mg/片，魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)10130106);大鼠白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒(美國(guó) R＆D Systems公司);抗大鼠單克隆抗體anti-CD4-FITC、anti-IL-17A-PE(美國(guó)Biolegend公司);酶標(biāo)儀(MK3型，Thermo Scientific公司);流式細(xì)胞儀(FACS，美國(guó) Beckmancoulter公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及干預(yù) 將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(對(duì)照組)、哮喘組、治療組，每組10只。哮喘組和治療組制作慢性支氣管哮喘模型:于第1、8 d腹腔注射 OVA和氫氧化鋁［Al(OH)3］干粉混合液 1 mL［含 OVA 100 mg、Al(OH)3100 mg］;于第15 d予2%OVA溶液噴霧激發(fā)，30 min/次，1次/d，連續(xù)激發(fā)8周。治療組于每次霧化激發(fā)前1 h予孟魯司特10 mg/kg灌胃，1次/d，共8周。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)第1、8 d用等量生理鹽水灌胃;于第15 d開(kāi)始予生理鹽水吸入刺激，30 min/次/d，連續(xù)激發(fā)8周。

1.2.2 觀察項(xiàng)目 末次給藥后24 h內(nèi)測(cè)定各組以下指標(biāo)。

1.2.2.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細(xì)胞(PMN)總數(shù)及細(xì)胞分類 麻醉大鼠，分離氣管T形切口，插入塑料管并固定，用5 mL生理鹽水進(jìn)行肺泡灌洗，收集BALF，反復(fù)2次(回收率約80%);離心BALF，沉淀細(xì)胞用1 mL生理鹽水重新懸浮，吹打均勻后計(jì)數(shù)PMN總數(shù)并行細(xì)胞分類(HE染色)，計(jì)算PMN、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、單核巨噬細(xì)胞(Mf)及淋巴細(xì)胞(Ly)所占比例。

1.2.2.3 肺組織病理改變及氣道形態(tài)學(xué)參數(shù) 上述指標(biāo)測(cè)定后處死各組大鼠，取左肺葉固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)脫水、石蠟包埋及切片，HE染色后觀察肺組織病理特點(diǎn)。肺組織切片在顯微鏡下放大400倍，每張切片隨機(jī)選取直徑100～200 μm完整的小支氣管橫斷面3個(gè)，用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件Imag-Pro Plus 6.0測(cè)定其基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(WAt)、平滑肌面積(WAm)，計(jì)算總管壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm)。

1.2.2.4 相關(guān)性分析 對(duì) WAm/Pbm 及 BALF中PMN總數(shù)與TH17細(xì)胞比例、IL-17水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用±s表示，行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊數(shù)據(jù)兩樣本均數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析;方差不齊采用校正t檢驗(yàn)，多重比較時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn);兩變量的相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 BALF中PMN總數(shù)及細(xì)胞分類 哮喘組BALF中PMN總數(shù)及PMN、EOS所占比例均高于對(duì)照組和治療組(P均＜0.01);治療組均明顯少于哮喘組，但明顯高于對(duì)照組(P均＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組BALF中PMN總數(shù)及細(xì)胞分類(n=10，±s)

表1 各組BALF中PMN總數(shù)及細(xì)胞分類(n=10，±s)

注:與對(duì)照組比較，#P ＜ ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 細(xì)胞總數(shù)(×109/L)PMN總數(shù)(×108/L)細(xì)胞分類(%)PMN EOS Mf Ly對(duì)照組 3.53 ±0.400 2.86 ±0.40 8.09 ±0.89 1.19 ±0.30 82.87 ±1.75 7.85 ±2.10哮喘組 6.73 ±0.45# 10.81 ±0.95# 16.05 ±0.60# 7.55 ±0.79 76.01 ±1.61# 12.71 ±1.43治療組 4.82 ±0.52#△ 5.30 ±0.74#△ 10.97 ±0.64#△ 2.16 ±0.29#△ 63.68 ±0.59#△ 10.85 ±2.51#△

2.2 Th17細(xì)胞比例及血清IL-17水平 哮喘組Th17細(xì)胞比例高于對(duì)照組及治療組(P均＜0.01)，治療組高于對(duì)照組而低于哮喘組(P均＜0.01)。哮喘組血清IL-17水平高于對(duì)照組和治療組(P均＜0.01)，而治療組高于對(duì)照組但低于哮喘組(P均＜0.01)。見(jiàn)表 2。

表2 各組Th17細(xì)胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

表2 各組Th17細(xì)胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

注:與對(duì)照組比較，#P ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 Th17細(xì)胞比例(%) IL-17(pg/mL)對(duì)照組0.76 ±0.73 20.36 ±0.99哮喘組 1.95 ±0.22# 76.31 ±1.46#治療組 1.43±0.34#△ 42.25±0.90#△

2.3 肺組織病理改變氣道形態(tài)學(xué)參數(shù) 對(duì)照組細(xì)小支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛排列整齊，支氣管黏膜上皮完整，未見(jiàn)或少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);哮喘組可見(jiàn)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞腫脹，杯狀細(xì)胞增生，部分上皮細(xì)胞變性、壞死脫落;支氣管管壁增厚、管腔狹窄甚至完全閉塞，支氣管腔內(nèi)大量黏液分泌，黏液栓形成;支氣管管腔、管壁黏膜及黏膜下、肺間質(zhì)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞(PMN、EOS、Ly)浸潤(rùn);治療組上述氣道改變癥狀較哮喘組明顯減輕，氣管壁黏膜有輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。各組Pbm比較無(wú)明顯差異。哮喘組WAt/Pbm及WAm/Pbm均明顯高于對(duì)照組及治療組(P均＜0.01)，治療組高于對(duì)照組、但低于哮喘組 (P均＜0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較(n=10，±s)

表3 各組氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較(n=10，±s)

注:與對(duì)照組比較，#P ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 Pbm(μm)WAt/Pbm WAm/Pbm對(duì)照組495.40 ±32.85 24.46 ±1.51 6.55 ±0.75哮喘組 537.17 ±41.06 50.97 ±3.48# 13.53 ±2.31#治療組 518.98 ±30.64 38.12 ±2.95#△ 8.25 ±0.97#△

2.5 相關(guān)性分析 WAm/Pbm與TH17細(xì)胞比例及IL-17水平呈顯著正相關(guān)(r=0.803，P ＜0.01;r=0.893，P ＜0.01)。BALF中 PMN 與 TH17細(xì)胞比例及 IL-17水平呈顯著正相關(guān)(r=0.870，P ＜0.01;r=0.975，P ＜0.01)。

3 討論

支氣管哮喘的發(fā)生涉及多種細(xì)胞因子、化學(xué)因子和相關(guān)細(xì)胞成分，是一種與免疫功能紊亂有關(guān)，以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為重要特征的慢性疾病［3］。氣道重塑是呼吸道反復(fù)炎癥損傷與修復(fù)的結(jié)果，可導(dǎo)致不可逆性呼吸道阻塞及肺功能損害，是難治性哮喘的主要病理基礎(chǔ)［4］。

研究證實(shí)，EOS浸潤(rùn)是引起哮喘的中心環(huán)節(jié)，但越來(lái)越多的研究顯示，PMN引起的氣道炎癥也起重要作用，尤其在重度哮喘的氣道炎癥和重塑過(guò)程中可能起重要作用［5］。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中，活化的PMN產(chǎn)生各種酶、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、IL-8、IL-6、血小板活化因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白三烯(LT)等，參與黏液腺增生和黏液栓形成、氣道重構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程［6］。本研究哮喘組 BALF中PMN、EOS均明顯高于對(duì)照組，證實(shí)PMN參與了氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類 T細(xì)胞亞群，IL-17是其分泌的特征性細(xì)胞因子。最新研究顯示，IL-17參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展，可能是激素抵抗型哮喘或重癥哮喘的重要發(fā)病機(jī)制之一［7］。作為一種前炎癥因子，IL-17具有很強(qiáng)的促炎癥作用，可以促進(jìn)支氣管纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等活化和成熟，使這些細(xì)胞高度表達(dá)分泌IL-6、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、腫瘤壞死因子γ(TNF-γ)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-2)、MMPs，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集和慢性炎癥的產(chǎn)生，造成免疫炎癥損傷［8］，還可增加氣道高反應(yīng)程度［9］。Wilson 等［10］研究顯示，IL-17 可促進(jìn)PMN活化和趨化，加重氣道炎癥，參與氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，哮喘組BALF中PMN、WAt/Pbm、Am/Pbm、Th17細(xì)胞比例、血清IL-17水平均明顯高于對(duì)照組，提示Th17細(xì)胞及IL-17參與了哮喘的發(fā)生，與目前研究報(bào)道一致。

半胱氨酰白三烯(CysLT)是哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的主要炎性反應(yīng)介質(zhì)，通過(guò)與各種靶細(xì)胞上Cys-LT1Rs結(jié)合，促進(jìn)呼吸道內(nèi)炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集和黏液分泌，增加血管通透性和氣道高反應(yīng)性，引起呼吸道平滑肌收縮，促進(jìn)呼吸道結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷和增殖，從而參與呼吸道炎性反應(yīng)及重塑的發(fā)生過(guò)程［11，12］。孟魯司特是一種強(qiáng)效選擇性CysLT1Rs拮抗劑，能與人體呼吸道中CysLT1Rs高度選擇性結(jié)合，阻斷Cys-LT的病理作用，抑制氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性，抑制氣道重塑［13，14］。Wang 等［15］報(bào)道，自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型中CysLT1受體信號(hào)不影響致病性輔助性T細(xì)胞的分化，孟魯司特卻可以抑制髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白特異性T細(xì)胞中IL-17的分泌。本研究結(jié)果顯示，孟魯司特可使OVA致敏哮喘大鼠氣道炎癥及平滑肌厚度增厚程度減輕，對(duì)氣道重塑有明顯的抑制作用;同時(shí)可抑制Th17的分化及IL-17釋放，使BALF中PMN減少，減輕炎癥細(xì)胞在支氣管內(nèi)的積聚。

綜上所述，孟魯司特可減輕哮喘大鼠的氣道炎癥及抑制其氣道重塑;其機(jī)制可能為抑制Th17細(xì)胞活化，減少IL-17的合成和釋放。

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