劉 淼，張 月，何敏紅，周 玲，鄭 航

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院，廣州510515)

研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食女性發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，食物中多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(AA)攝入過(guò)多可增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［1～4］。AA主要經(jīng)過(guò)環(huán)氧化酶(COX)與脂氧合酶(LOX)途徑進(jìn)行代謝;乳腺癌患者LOX代謝產(chǎn)物的表達(dá)增加［5，6］。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝的中心信號(hào)分子，其過(guò)度激活可導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常。乳腺癌患者存在mTOR信號(hào)通路的過(guò)度活化［7，8］。2012年12月～2013年6月，我們將LOX代謝產(chǎn)物5-羥二十烷四烯酸(HETE)、12-HETE及mTORC1抑制劑雷帕霉素(Rap)作用于體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，探討mTORC1在5、12-HETE促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胰酶及胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司，5-HETE及12-HETE購(gòu)自Cayman Chemical公司，Rap購(gòu)自美國(guó)惠氏公司，β-actin、S6、山羊抗兔、兔抗山羊二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，P-S6(Ser235/236)抗體購(gòu)自Cell Signaling Inc公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度適時(shí)更換培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代或接種于6、24、96孔板培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分為四組，對(duì)照組加入0.1%DMSO，HETE組加入5-HETE 及12-HETE 15 μmol/L，Rap 組加入 Rap 100 μmol/L，HETE+Rap 組加入 Rap 100 μmol/L 及 5-HETE+12-HETE 15 μmol/L。每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對(duì)照，以空白孔調(diào)零。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 細(xì)胞增殖率 采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，放在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)作用4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定各組450 nm處測(cè)定光密度值，取6孔平均值表示MCF-7細(xì)胞增殖率。

1.2.2.2 mTORC1 通路蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法檢測(cè)mTORC1通路下游蛋白P-S6(S235/236)的表達(dá)水平。各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解，刮離細(xì)胞移入EP管內(nèi)100℃煮沸10 min。將制備的蛋白樣品進(jìn)行8% ～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5～2 h，Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(恒壓100 V，約90 min)。5%脫脂奶粉/TBST于平緩搖床上室溫封閉1 h，加入檢測(cè)蛋白的抗體(P-S6、S6及 β-actin)，于平緩搖床上室溫孵育4℃孵育過(guò)夜。TBST振蕩洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。洗膜3次加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色1 min左右，于暗盒內(nèi)與X線膠片貼在一起進(jìn)行曝光，X線膠片經(jīng)顯影、定影后掃描保存，檢測(cè)P-S6、β-actin蛋白灰度值。

1.2.2.3 細(xì)胞遷移距離 各組細(xì)胞接種至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度長(zhǎng)至100%開始進(jìn)行劃痕試驗(yàn)。加入2 μg/mL絲裂霉素、0.5%血清培養(yǎng)基中孵育24 h，然后使用200 μL移液槍頭自上而下劃一條痕。各組細(xì)胞加藥之后立即在顯微鏡下拍照并記錄劃痕的間距，分別于18、36 h后在顯微鏡下與前同樣方法拍照并記錄劃痕距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊時(shí)多組間比較采用方差分析，然后采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。方差不齊時(shí)采用Welch法行多組間比較，然后采用Dunnet＇s T3法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率 對(duì)照組、HETE組、Rap組、HETE+Rap組細(xì)胞增殖率分別為 0.85 ±0.01、1.20 ±0.13、0.53 ± 0.08、0.54 ± 0.01，HETE 組細(xì)胞增殖率高于對(duì)照組，HETE+Rap組低于HETE組(P均＜0.05)。

2.2 mTORC1通路蛋白表達(dá) 對(duì)照組、HETE組、Rap組、HETE+Rap組 P-S6蛋白灰度值分別為83.51 ±5.06、127.4 ±9.34、47.07 ±3.58、56.24 ±4.49，HETE組P-S6蛋白水平高于對(duì)照組，HETE+Rap組低于HETE組(P均＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組P-S6蛋白表達(dá)水平

2.3 細(xì)胞遷移距離 HETE組MCF-7細(xì)胞18、36 h后遷移距離大于對(duì)照組(P＜0.01)。HETE+Rap組細(xì)胞遷移距離小于HETE組(P＜0.05)，與對(duì)照組相仿。見(jiàn)表1。

3 討論

AA是人體的一種必需脂肪酸，屬于n-6系列的多不飽和脂肪酸。AA廣泛參與自身免疫、過(guò)敏、哮喘、炎癥等多種生理過(guò)程，與腫瘤的形成與發(fā)展也密切相關(guān)。AA可被轉(zhuǎn)化為不同種類的類花生酸物質(zhì)，可經(jīng) LOX途徑代謝為5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE等，可通過(guò)具有生物活性的代謝產(chǎn)物影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝，并與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生有關(guān)，如激活P44/22有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3K/Akt激酶途徑，可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA合成。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者乳腺癌組織中AA代謝產(chǎn)物5-LOX與12-LOX均有高表達(dá)，提示AA能增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，并與乳腺癌的進(jìn)展程度和預(yù)后密切相關(guān)［9～11］。本研究發(fā)現(xiàn)，HETE 組MCF-7細(xì)胞增殖率高于對(duì)照組，提示5、12-HETE能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，在乳腺癌發(fā)生中起重要作用。

表1 各組MCF-7細(xì)胞遷移距離(μm，±s)

表1 各組MCF-7細(xì)胞遷移距離(μm，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與 HETE 組比較，#P ＜0.05

組別 遷移距離18 h 36 h HETE 組 632.96 ±24.81 748.08 ±22.82#Rap 組 512.31 ±16.88 633.25 ±30.20#HETE+Rap 組 520.74 ±32.31 630.46 ±24.85#對(duì)照組506.83 ±24.66 617.37 ±15.79

mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)與其它分子形成復(fù)合物而行使生物學(xué)功能，目前認(rèn)為主要形成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物。它整合了營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、能量代謝和應(yīng)激等多個(gè)信號(hào)通路，控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活與代謝，與細(xì)胞能量代謝、脂類合成、增殖、凋亡相關(guān)［12］。mTORC1下游的直接底物為S6K1及4E-BP1，核糖體蛋白S6作為S6K1的底物磷酸化后促進(jìn)核糖體的發(fā)生，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖，可作為mTORC1活性檢測(cè)的重要指標(biāo)。Rap是mTOR特異抑制劑，用于治療癌癥、抗移植排斥等［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，5、12-HETE使 MCF-7細(xì)胞 mTORC1下游 S6的磷酸化水平升高，且這種磷酸化作用可被mTORC1抑制劑 Rap抑制;同時(shí) Rap可抑制5、12-HETE對(duì) MCF-7細(xì)胞的促增殖作用，提示5、12-HETE對(duì)MCF-7細(xì)胞的促增殖作用中存在mTORC1通路激活，說(shuō)明mTORC1通路參與5、12-HETE促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，HETE組MCF-7細(xì)胞遷移距離大于對(duì)照組，HETE+Rap組細(xì)胞遷移距離小于HETE組，提示5、12-HETE可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移，這種遷移作用可被mTORC1抑制劑Rap抑制，說(shuō)明mTORC1參與了5、12-HETE促進(jìn)乳腺癌遷移的過(guò)程。

綜上所述，mTORC1在5、12-HETE促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這為乳腺癌發(fā)病機(jī)理提供新內(nèi)容，為發(fā)展5、12-HETE及mTORC1抑制劑、單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療乳腺癌的新策略提供了理論依據(jù)。

［1］Aggarwal BB，Vijayalekshmi RV，Sung B.Targeting inflammatory pathways for prevention and therapy of cancer:short-term friend，long-term foe［J］.Clin Cancer Res，2009，15(2):425-430.

［2］Lee MM，Lin SS.Dietary fat and breast cancer［J］.Annu Rev Nutr，2000，20(4):221-248.

［3］Capone SL，Bagga D，Glaspy JA.Relationship between omega-3 and omega-6 fatty acid ratios and breast cancer［J］.Nutrition，1997，13(9):822-824.

［4］Holmes MD，Hunter DJ，Colditz GA，et al.Association of dietary intake of fat and fatty acids with risk of breast cancer［J］.JAMA，1999，281(10):914-920.

［5］Singh-Ranger G，Salhab M，Mokbel K.The role of cyclooxygenase-2 in breast cancer:review［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，109(2):189-198.

［6］Jiang WG，Douglas-Jones AG，Mansel RE.Aberrant expression of 5-lipoxygenase-activating protein(5-LOXAP)has prognostic and survival significance in patients with breast cancer［J］.Prostagl Leukot Essent Fatty Acids，2006，74(2):125-134.

［7］Jiang WG，Douglas-Jones AG，Mansel RE.Reduction of isoforms of 15-lipoxygenase(15-LOX)-1 and 15-LOX-2 in human breast cancer［J］.Prostagl Leukot Essent Fatty Acids.2006，74(4)，235-445.

［8］Guertin DA，Sabatini DM.Defining the role of mTOR in cancer［J］.Cancer Cell，2007，12(1):9-22.

［9］Pidgeon GP，Lysaght J，Krishnamoorthy S，et al.Lipoxygenase metabolism:roles in tumor progression and survival［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26(3-4):503-524.

［10］You J，Mi D，Zhou X，et al.A positive feedback between activated extracellularly regulated kinase and cyclooxygenase/lipoxygenase maintains proliferation and migration of breast cancer cells［J］.Endocrinology，2009，150(4):1607-1617.

［11］Li DM，F(xiàn)eng YM.Signaling mechanism of cell adhesion molecules in breast cancer metastasis:potential therapeutic targets［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，128(1):7-21.

［12］Mathieu L，David M.Sabatini G.mTOR signaling at a glance［J］.J Cell Sci，2009，122(20):3589-3594.