步玉輝，史建紅，崔乃鵬，何 歡，王 冰，陳保平

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000;2河北大學(xué))

目前乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但部分患者確診時(shí)已出現(xiàn)局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，5年生存率很低［1］。研究發(fā)現(xiàn)，血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)在腫瘤血管形成、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，可能參與了乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過程［2］。2013年 9月 ～2014年 1月，我們觀察了PDGF-BB對(duì)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞遷移、增殖的影響，旨在進(jìn)一步探討乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制及其干預(yù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 人源性SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibico公司，胎牛血清購自Biological公司，胰蛋白酶消化液購自Sigma公司，PDGF-BB購自Pepro Tech公司;MTS CellTiter 96 A Queous One Solution Cell Proliferation Assay Kit購自Promega公司

1.1.3 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈臺(tái)(青島海爾股份有限公司)，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司 CKX41);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Sigma公司)，Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDGF-BB對(duì)SK-BR-3細(xì)胞遷移能力影響的觀察 采用劃痕試驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-BR-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，鋪于6孔板中的血蓋片上，每孔樣品體積為100 μL，另加入10%胎牛血清 RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL。設(shè)定1個(gè)孔為對(duì)照組不加藥，4孔加PDGF-BB使其終濃度分別為0.5、1、2、4 ng/mL，棄 1 個(gè)孔。于 37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，改用含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用移液管尖端在每孔血蓋片相同位置作線性劃痕，PBS洗去漂浮細(xì)胞，保持PDGF-BB濃度不變，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，倒置顯微鏡下測(cè)量其遷移距離。

1.2.2 PDGF-BB對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖能力影響的觀察 采用CellTiter 96 A Queous單溶細(xì)胞增殖試劑盒。按說明書要求，取96孔板每孔加入100 μL含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為2×104/mL，于 37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度 90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，改用含2%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，加入終濃度分別為 0、0.5、1、2、4 ng/mL 的 PDGF-BB 培養(yǎng) 24 h。取 10 μL 細(xì)胞懸液與0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合染色至計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。每孔加入20 μL增殖試劑于相同條件下培養(yǎng)4 h，使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其490 nm波長(zhǎng)的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有結(jié)果至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGF-BB對(duì)SK-BR-3細(xì)胞遷移能力的影響不同濃度PDGF-BB培養(yǎng)12、24、48 h后SK-BR-3細(xì)胞平均遷移距離見表1。由表1可見，PDGF可增強(qiáng)SK-BR-3細(xì)胞的遷移能力，平均遷移距離與PDGFBB濃度及時(shí)間呈正相關(guān)(P均＜0.05)。

2.2 PDGF-BB對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖能力的影響0、0.5、1、2、4 ng/mL 的 PDGF-BB 培養(yǎng) 24 h 后 SKBR-3平均細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為 1.02 ×104、3.81 ×104、6.41 ×104、2.54 ×105、6.82 ×105，繼續(xù)加入增殖試劑后于490 nm處測(cè)平均 OD值分別為1.012、1.719、2.692、3.934、5.877，SK-BR-3 平均細(xì)胞計(jì)數(shù)及平均OD值與PDGF-BB濃度及時(shí)間呈正相關(guān)(P均 ＜0.05)。

表1 不同濃度PDGF-BB干預(yù)后SK-BR-3細(xì)胞平均遷移距離比較(±s)

表1 不同濃度PDGF-BB干預(yù)后SK-BR-3細(xì)胞平均遷移距離比較(±s)

PDGF-BB濃度(ng/mL) 平均遷移距離(cm)干預(yù)12 h 干預(yù)24 h 干預(yù)48 h 0 0.2 0.4 1.0 0.5 0.4 0.8 1.0 1 1.0 1.2 1.2 2 1.2 1.6 2.0 4 1.6 1.8 2.2

3 討論

PDGF可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞以及其他間充質(zhì)來源細(xì)胞的分化、增殖［3］。胚胎發(fā)育過程中，PDGF在腎臟、血管、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過程中起著舉足輕重的作用。PDGF過表達(dá)可能引起和促進(jìn)某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。目前發(fā)現(xiàn) PDGF家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C 以及 PDGF-D，其在自然界主要以由二硫鍵連接的PDGF-A和PDGF-B同源或異源二聚體的形式存在，即PDGF-AA、PDGF-BB和 PDGF-AB［1］。

本研究結(jié)果顯示，PDGF-BB可增強(qiáng)SK-BR-3細(xì)胞的遷移能力，此效果與PDGF-BB濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，PDGF在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，且與腫瘤的生物學(xué)屬性及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5～8］。PDGF可以與含有β-酪氨酸激酶受體的PDGF受體α、β特異性結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。這兩種受體的胞外結(jié)構(gòu)域類似，且均由五種免疫球蛋白組成，而胞內(nèi)部分則由大約100個(gè)非同源性的氨基酸殘基的激酶區(qū)域組成。與PDGF結(jié)合主要發(fā)生在類免疫球蛋白的2和3區(qū)域，但是穩(wěn)定性不如與類免疫球蛋白4區(qū)域結(jié)合［9，10］。PDGF與其受體結(jié)合導(dǎo)致胞內(nèi)相鄰部分的自身磷酸化。這種自身磷酸化有兩種重要的功能。首先它改變了胞內(nèi)受體的構(gòu)象，激活激酶。目前仍然沒有對(duì)PDGF受體三維結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確描述，對(duì)其控制機(jī)制的研究也還是空白，但是有三種假說:①激酶結(jié)構(gòu)域中激活環(huán)的折疊很可能掩蓋了激活位點(diǎn)，自身磷酸化的發(fā)生使得該激活位點(diǎn)暴露［11］;②膜受體可能折疊在激活環(huán)中，該區(qū)域的兩種酪氨酸殘基的自身磷酸化改變激酶構(gòu)象使其激活［12］;③受體的C末端可能折疊掩蓋激酶的結(jié)構(gòu)域，酪氨酸C末端的自身磷酸化使得激酶激活［13］。第二自身磷酸化可與SH2結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性結(jié)合。PDGFRα和PDGFRβ分別包含10個(gè)和11個(gè)已知的自身磷酸化的酪氨酸殘基［14］。鑒于PDGF對(duì)腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，故可尋求PDGF的受體作為治療腫瘤的重要的分子靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示PDGF-BB可促進(jìn)SK-BR-3細(xì)胞增殖，并與濃度和時(shí)間存在依賴性。其機(jī)制可能是PDGF-BB-PDGFR-β信號(hào)通路激活并啟動(dòng)促紅細(xì)胞生成素系統(tǒng)，其主要通過轉(zhuǎn)錄因子Atf3的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，此外還可能有兩個(gè)輔助性轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、Sp1參與轉(zhuǎn)錄。PDGF-BB通過促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制主要是:①腫瘤血管形成時(shí)的旁分泌刺激產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素，而腫瘤血管是由內(nèi)皮細(xì)胞直接誘導(dǎo)增殖、遷移、出芽形成的;②PDGFBB還可誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素mRNA并使其過表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，增加氧灌注和防止腫瘤出現(xiàn)相關(guān)性貧血［15］。有研究證實(shí)，PDGFBB 能夠刺激腫瘤血管形成［16～18］。因此，PDGF-BB可作為診斷腫瘤和判斷其預(yù)后的標(biāo)志之一。由于PDGF信號(hào)通路的存在，我們推測(cè)促紅細(xì)胞生成素水平升高可能影響抗腫瘤血管生成治療的效果。正確選擇特異性PDGF受體抑制劑，抑制其信號(hào)通路將為尋找新的抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的化療藥物、降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新思路，為延長(zhǎng)患者壽命開辟新路徑。

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