■張顏婷 趙國芬
(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010010)
共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是具有共軛雙鍵的位置和幾何異構(gòu)體十八碳烯酸的統(tǒng)稱。其共軛雙鍵通常位于C9和C11位或C10和C12位,每個(gè)雙鍵可以以順式或反式構(gòu)型存在[1]。共軛亞油酸的立體異構(gòu)體多達(dá)十幾種,以cis-9,trans-11-CLA(c9t11),trans-10、cis-12-CLA(t10c12),trans-9、trans-11-CLA(t9t11)和 cis-10、cis-12-CLA(c10c12)等異構(gòu)體為主,其中具有生物學(xué)功能的兩種異構(gòu)體為cis-9、trans-11-CLA(c9t11)和 trans-10、cis-12-CLA(t10c12)[2]。研究表明,CLA具有諸多的生理功能,如抗癌、調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)肌體免疫力、促進(jìn)骨組織代謝、促進(jìn)生長發(fā)育[3-8]、治療糖尿病[9]、減少皮膚感染[10]、減少脂肪[11]和抗動(dòng)脈粥樣硬化[12-13]等,其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)。
亞油酸異構(gòu)酶(linoleic acid isomerase,LAI)可以專一地將亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸。與目前應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)異構(gòu)法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)CLA相比,利用重組菌誘導(dǎo)表達(dá)并純化產(chǎn)生的LAI催化亞油酸產(chǎn)生CLA,不僅可以獲得高活性、高純度的CLA,還解決了微生物發(fā)酵過程中發(fā)酵條件苛刻、菌體生產(chǎn)能力局限和菌體代謝產(chǎn)物不易與產(chǎn)品分離等問題。
本試驗(yàn)以重組LAI工程菌為試驗(yàn)菌株,對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究,以進(jìn)一步優(yōu)化重組LAI工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件,為后續(xù)酶的純化、利用以及工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
亞油酸純度≥99%(Sigma)、氨芐青霉素(amresco)、IPTG(amresco)、牛血清白蛋白(Scientific Research Special)、正己烷(永大試劑)、蛋白胨(環(huán)凱微生物)、酵母提取物(環(huán)凱微生物)、Tris(amresco)、甘油(永大試劑)、咪唑(Vetec)、NaCl(永大試劑)、NTA-0、100、200、400分別為濃度20 mM Tris-HCl(pH值 7.9),0.5 M NaCl及10%甘油,添加0、100、200、400 mM咪唑、JM109-pQE30a-LAI(實(shí)驗(yàn)室保存)。
將-80℃保存的重組菌接種于固體LB培養(yǎng)基上,劃線培養(yǎng),37℃靜置培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接于液體LB培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)24 h即得種子液。
1.3.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇
將種子液接于液體培養(yǎng)基,在37℃搖床中分別培養(yǎng)1、3、5、7、10 h,培養(yǎng)結(jié)束后,向培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mM IPTG繼續(xù)37℃培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌,PBS洗滌,破碎菌體進(jìn)行酶活力的測定。
1.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇
將種子液接于液體培養(yǎng)基,在37℃搖床中培養(yǎng)7 h,培養(yǎng)結(jié)束后,向培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mM IPTG繼續(xù)37 ℃培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌,PBS洗滌,破碎菌體進(jìn)行酶活力的測定。
1.3.3 誘導(dǎo)劑濃度的選擇
將種子液接于液體培養(yǎng)基,在37℃搖床中培養(yǎng)7 h,培養(yǎng)結(jié)束后,向培養(yǎng)基中加入IPTG,終濃度分別為0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM,繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)15 h,培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌,PBS洗滌,破碎菌體進(jìn)行酶活力的測定。
1.3.4 誘導(dǎo)溫度的選擇
將種子液接于液體培養(yǎng)基,在37℃搖床中培養(yǎng)7 h,培養(yǎng)結(jié)束后,向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mM IPTG繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、37 ℃,繼續(xù)培養(yǎng)15 h,培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌,PBS洗滌,破碎菌體進(jìn)行酶活力的測定。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。
稱菌體濕重,加入10倍體積的PBS,利用超聲波破碎儀對(duì)菌體進(jìn)行破碎。破碎后,離心所得的上清液即為粗酶液。
利用考馬斯亮藍(lán)法[14]對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。
1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以PBS為溶劑,分別配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg∕ml的牛血清白蛋白溶液,分別取1 ml加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,反應(yīng)5 min后搖勻,測定OD595nm,以牛血清白蛋白質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),OD595nm為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6.2 樣品的測定
取適當(dāng)稀釋后的樣品1 ml加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,反應(yīng)5 min后搖勻,測定OD595nm,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。
1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以正己烷為溶劑,分別配制0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg∕ml的CLA溶液,測定OD233nm,以CLA質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),OD233nm為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.7.2 亞油酸懸濁液的制備
取亞油酸 0.5 ml,Tween-80 0.5 ml,用去離子水99 ml,超聲乳化,即得亞油酸乳濁液。
1.7.3 酶活力的測定
取3 ml亞油酸乳濁液加入粗酶液200 μl,37℃振蕩培養(yǎng)2 h,向反應(yīng)液中加入10%三氯乙酸結(jié)束反應(yīng),再加入10 ml正己烷進(jìn)行振蕩萃取,測定OD233nm[15]。根據(jù)下述公式進(jìn)行酶活力的計(jì)算。
式中:K——稀釋倍數(shù);
G——生成的CLA含量(μg);
V——取酶液的體積(ml);
T——反應(yīng)時(shí)間(h)。
以正交試驗(yàn)所得的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)重組LAI進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)效果進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
以不同濃度牛血清白蛋白與考馬斯亮藍(lán)G-250反應(yīng)后測定OD595nm值,以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。
圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖1可知,蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2=0.997 7,標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可信性,可以使用。
在233 nm處測定不同CLA濃度的正己烷溶液的OD233nm值,以O(shè)D233nm為縱坐標(biāo),CLA的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。
圖2 共軛亞油酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖2可知,共軛亞油酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2=0.999 3,標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可信性,可以使用。
2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇
對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)分別為1、3、5、7、10 h誘導(dǎo)表達(dá)的LAI粗酶液進(jìn)行了酶活力測定,結(jié)果如圖3。
圖3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇
由圖3可知,隨著誘導(dǎo)前菌體培養(yǎng)時(shí)間的延長,誘導(dǎo)表達(dá)的LAI的酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當(dāng)誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間為7 h時(shí),酶活力最大達(dá)到3 074.5 U∕ml。由于IPTG能抑制菌體生長,過早的加入IPTG會(huì)導(dǎo)致重組菌菌體生物量偏低,產(chǎn)酶能力受限,此時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力較低;當(dāng)重組菌生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期,隨著菌體的快速增殖,重組菌的產(chǎn)酶能力升高,誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力不斷升高;當(dāng)重組菌進(jìn)入穩(wěn)定期后,菌體數(shù)目不再增加,但由于菌體生長產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及有害物質(zhì)的積累,此時(shí)菌體的產(chǎn)酶能力與對(duì)數(shù)期時(shí)相比較差,誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力有所下降。因此,重組LAI的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h。
2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇
對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間分別為5、10、15、20、25 h誘導(dǎo)表達(dá)的LAI粗酶液進(jìn)行了酶活力測定,結(jié)果如圖4。
圖4 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇
由圖4可知,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長,誘導(dǎo)表達(dá)的LAI的酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)15 h時(shí),酶活力達(dá)到最大,為3 182.3 U∕ml。由于培養(yǎng)時(shí)間為0~15 h時(shí)重組菌生長由延遲期到達(dá)穩(wěn)定期,這一時(shí)期內(nèi)LAI的誘導(dǎo)表達(dá)可以正常進(jìn)行,所以酶活力不斷上升;而隨著時(shí)間的延長,20 h后重組菌生長進(jìn)入衰亡期,菌體發(fā)生自溶和蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象,LAI也不可避免的被降解,所以酶活力出現(xiàn)下降的趨勢。因此,重組LAI最佳誘導(dǎo)時(shí)間為15 h。
2.3.3 誘導(dǎo)劑濃度的選擇
對(duì)誘導(dǎo)劑濃度分別為 0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM誘導(dǎo)表達(dá)的LAI粗酶液進(jìn)行了酶活力測定,結(jié)果如圖5。
圖5 誘導(dǎo)劑濃度的選擇
由圖5可知,隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的LAI活力出現(xiàn)先升后降趨勢,當(dāng)IPTG濃度為0.1 mM時(shí),LAI活力最大,可達(dá)2 527.1 U∕ml。由于誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)于重組菌具有一定的毒害作用,低濃度的IPTG對(duì)重組菌毒害作用不明顯,但是對(duì)LAI誘導(dǎo)表達(dá)的效率也相對(duì)較低,此時(shí)LAI活力不高;隨著IPTG濃度的增加,IPTG對(duì)LAI誘導(dǎo)表達(dá)的效率增高,LAI活力增大;而當(dāng)IPTG濃度進(jìn)一步增高時(shí),其對(duì)于重組菌的毒害作用也愈加明顯,導(dǎo)致重組菌生長受限,不能很好地表達(dá)LAI,使得LAI活力降低。因此,重組LAI最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mM。
2.3.4 誘導(dǎo)溫度的選擇
對(duì)誘導(dǎo)溫度分別為20、25、30、37℃誘導(dǎo)表達(dá)的LAI粗酶液進(jìn)行了酶活力測定,結(jié)果見圖6。
圖6 誘導(dǎo)溫度的選擇
由圖6可知,隨著誘導(dǎo)溫度的升高,誘導(dǎo)表達(dá)的LAI的酶活力出現(xiàn)先升后降的趨勢,當(dāng)溫度為25℃時(shí),LAI的酶活力最大,可達(dá)2 836.9 U∕ml。由于低溫誘導(dǎo)酶表達(dá)時(shí),酶可以正確折疊,但酶的表達(dá)速率低,總體表現(xiàn)為酶活力不高;而隨著溫度的升高,酶的表達(dá)速率加快,酶活力也逐漸升高;但當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí),酶折疊速率加快,致使形成的酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤率增高,總體表現(xiàn)為酶活力降低,因此,25℃為LAI誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度。
根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,試驗(yàn)結(jié)果如表2和表3。
表1 正交試驗(yàn)因素水平
由表2可知,最佳誘導(dǎo)條件為:A2B1C3D3,即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h、誘導(dǎo)時(shí)間為10 h、誘導(dǎo)劑濃度為0.15 mM、誘導(dǎo)溫度為30℃,各因素對(duì)正交試驗(yàn)影響強(qiáng)弱關(guān)系為:B>D>C>A。由于最佳誘導(dǎo)條件在正交試驗(yàn)表中沒有對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組,在最佳誘導(dǎo)條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn),3組試驗(yàn)測得LAI酶活力結(jié)果分別為3 845.857 8、3 775.675 4、3 927.523 5 U∕ml,RSD=1.9741%,表明最佳誘導(dǎo)條件為A2B1C3D3時(shí)所得的LAI酶活力平均值為3 849.686 0 U∕ml。由表3可知,因素B、C、D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著,因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 正交試驗(yàn)方差分析
由圖7可知,陰性對(duì)照菌JM109和JM109-pQE30a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)沒有目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生,而重組菌JM109-pQE30a-LAI經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生了目的蛋白質(zhì),且大小約為64 kD,與預(yù)期相符。這表明陰性對(duì)照菌本身并不產(chǎn)生LAI,只有轉(zhuǎn)入了LAI基因的重組菌才能經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生LAI,且產(chǎn)生的LAI大部分為可溶性的,有利于下一步親和層析純化LAI的進(jìn)行。
圖7 重組LAI誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測
近年來,對(duì)于生物合成CLA的研究成為了食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn),隨著研究的深入,結(jié)合基因工程和酶工程的技術(shù),純化出高活性、高純度的LAI,利用酶直接催化亞油酸產(chǎn)生共軛亞油酸的方法,顯示出了顯著的優(yōu)越性。本試驗(yàn)通過對(duì)重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn),最佳誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h,誘導(dǎo)時(shí)間為10 h,誘導(dǎo)劑濃度為0.15 mM,誘導(dǎo)溫度為30℃。最佳誘導(dǎo)條件下,誘導(dǎo)出的亞油酸異構(gòu)酶的酶活力平均可達(dá)3 849.686 0 U∕ml。與天然發(fā)酵法和化學(xué)合成法獲得LAI相比,優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件的重組菌誘導(dǎo)表達(dá)出的LAI,具有活性高、異構(gòu)體單一、利于純化等優(yōu)點(diǎn),為后續(xù)酶的利用、開發(fā)和研究奠定了一定的基礎(chǔ)。