■楊奇慧 譚北平 王鳳美 董曉慧 遲淑艷 劉泓宇

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東湛江524088）

近年來，對蝦的規(guī)模化和集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）成為主要養(yǎng)殖的品種之一。凡納濱對蝦飼料中魚粉用量通常高達(dá)30%左右，成為對蝦飼料成本中最大的組成部分。長期以來，由于海洋漁業(yè)資源的減少及捕撈量的下降，魚粉資源供應(yīng)嚴(yán)重不足。我國使用的魚粉主要靠進(jìn)口，2011年魚粉進(jìn)口量已高達(dá)100萬噸以上，成為制約我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。因此，尋求可替代魚粉的蛋白源，成為水產(chǎn)營養(yǎng)與飼料研究的熱點之一。

水產(chǎn)動物不僅對飼料蛋白需求量高（凡納濱對蝦飼料蛋白水平高達(dá)40%以上），而且其對蛋白質(zhì)的消化能力較弱（馮昭信，2008）。因此，水產(chǎn)動物極易出現(xiàn)蛋白質(zhì)的消化不良和水質(zhì)變差的現(xiàn)象。因此，選擇優(yōu)質(zhì)氮源才能使水產(chǎn)動物的生產(chǎn)潛力最大程度地發(fā)揮。大量研究已證實，蛋白質(zhì)經(jīng)過動物消化后，是以小肽和氨基酸的形式被吸收（楊鳳，2005）。與氨基酸的吸收相比，小肽的吸收競爭低、耗能低、速度快、效率高（Gilbert等，2008）。小肽作為氮源有以下幾方面的優(yōu)勢：①可以緩解動物的消化負(fù)擔(dān)，提高飼料利用率（Sun等，2009）；②維持腸道結(jié)構(gòu)正常、促進(jìn)消化道和消化器官的生長發(fā)育、提高消化酶活性（楊義，2005）；③增強(qiáng)免疫能力（楊義，2005）；④促進(jìn)體蛋白沉積（Boza等，1995；樂國偉等，1998）。因此，將蛋白原料進(jìn)行體外酶解生產(chǎn)的小肽產(chǎn)品，既符合水產(chǎn)動物的生理需求特點，又能更有效地利用蛋白資源。植物蛋白源具有資源豐富、供應(yīng)穩(wěn)定、安全等方面的優(yōu)勢，成為制備小肽產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。

酶解植物蛋白（Enzymolysis plant protein，EPP）是以大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白等優(yōu)質(zhì)蛋白為原料，經(jīng)組合液態(tài)酶解工藝，生產(chǎn)的富含小肽的產(chǎn)品。本試驗旨在研究凡納濱對蝦飼料中添加不同水平的酶解植物蛋白與進(jìn)口魚粉組合，對凡納濱對蝦生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)和非特異性免疫能力的影響，尋找在凡納濱對蝦配合飼料中可替代魚粉的非常規(guī)蛋白源的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和飼料

試驗選擇健康對蝦苗720尾，平均分為6個處理組，每個處理設(shè)3個重復(fù)，放入18個0.5 m3的玻璃纖維鋼桶中，每桶40尾，分別投喂6種試驗飼料。以對蝦商業(yè)飼料作參考配制基礎(chǔ)飼料，以魚粉（秘魯進(jìn)口魚粉，含粗蛋白68%）、豆粕、花生粕作為蛋白源，魚油及大豆油作為脂肪源，并補(bǔ)充無機(jī)鹽、維生素等配制成基礎(chǔ)飼料。基礎(chǔ)飼料中分別添加0、2%、4%、6%、8%和10%的酶解植物蛋白（等量替代進(jìn)口魚粉），配制成6種試驗飼料（見表1）。在配制飼料過程中，各種原料粉碎過60目篩，按表1的配方準(zhǔn)確稱量各種飼料原料，微量添加成分采取逐級擴(kuò)大法混合均勻，再添加30%左右的水分，再次混勻后，壓制成粒徑為1.0 mm和1.5 mm的顆粒飼料。風(fēng)干后，用自封袋密封，放于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及主要營養(yǎng)成分（%）

1.2 飼料管理

試驗在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行。每天按對蝦體重的8%～10%投餌，分別在07：00、11：30、17：30、21：00共投喂4次。試驗用水為經(jīng)過沉淀和過濾的海水，每天觀察對蝦攝食、蛻殼、生長情況并記錄投喂量、水溫、pH值、鹽度、溶氧等水質(zhì)參數(shù)，每周定期測定水中氨氮含量，試驗期為56 d。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束前24 h停止投喂。試驗結(jié)束時，稱重并記尾數(shù)，計算增重率和成活率。每桶中隨機(jī)選取5尾蝦，保存于-20℃冰箱中，用于全蝦體成分分析；每桶再選取10尾蝦，用1 ml注射器從圍心腔中抽血，將血液置于1.5 ml Eppendorf中，待4℃冰箱中靜置過夜后離心，取上清液備用。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長性能指標(biāo)

增重率（%）=100×[終末均重(g)-初始均重(g)]∕初始均重(g)；特定生長率（%∕d）=100×{ln[終末均重(g)]-ln[初始均重(g)]}∕試驗天數(shù)(d)；飼料系數(shù)=攝食量(g)∕[終末體重(g)-初始體重(g)]；蛋白質(zhì)效率(%)=100×[終末體重(g)-初始體重(g)]∕（攝食量×飼料蛋白質(zhì)含量）；成活率（%）=100×終末蝦尾數(shù)∕初始蝦尾數(shù)。

1.4.2 體成分分析

參照AOAC（1995）方法，分別測定全蝦樣品中的水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的含量。其中：水分含量的測定通過用恒溫烘箱在105℃下，烘干至恒重測定水分含量；蛋白質(zhì)含量的測定采用自動凱氏定氮儀（2300-Auto-analyzer，F(xiàn)oss Tecator，Sweden）測定；脂肪含量的測定采用自動脂肪測定儀（Soxtec System 2050，F(xiàn)oss Tecator，Sweden）；灰分含量的測定是在550℃馬福爐中灼燒12 h后測得。

1.4.3 血清中非特異性免疫指標(biāo)測定

測定血清酚氧化酶(Phenol antioxidant enzyme,PO)、超氧化物歧化酶（Surperoxide dismutase,SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (Alanine aminotransferase，GPT)活性。血清中的超氧化物歧化酶活性按鄧碧玉等（1991）改良的聯(lián)苯三酚自氧化法測定；酚氧化酶活性參照Ashida等（1971）以L-dopa為底物比色的方法測定。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性用賴氏法測定。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)值用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）”表示，采用SPSS（12.0）統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），對組間有顯著差異的（P＜0.05），結(jié)合Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦生產(chǎn)性能的影響（見表2）

由表2可知，飼料中添加4%的酶解植物蛋白，對凡納濱對蝦的末重、增重率、飼料系數(shù)和特定生長率無顯著影響（P＞0.05）。添加6%～10%的酶解植物蛋白使飼料系數(shù)增加，而其它指標(biāo)均降低。隨酶解植物蛋白水平的升高，成活率未出現(xiàn)顯著的變化（P＞0.05）。

表2 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦生產(chǎn)性能的影響

2.2 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響（見表3）

表3 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，酶解植物蛋白對凡納濱對蝦血清葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的含量均有不同程度的影響，對總蛋白含量的影響不顯著（P＞0.05）。在此配方條件下，飼料中添加6%的酶解植物蛋白，對血清葡萄糖、膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦全蝦體成分的影響

由表4可知，飼料中添加2%～6%的酶解植物蛋白，可以提高凡納濱對蝦體蛋白含量。隨酶解植物蛋白添加水平的升高，凡納濱對蝦其他體成分的變化無明顯的規(guī)律性。

表4 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦全蝦體成分的影響(%)

2.4 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦血清酶活性的影響（見表5）

由表5可知，飼料中添加6%的酶解植物蛋白，對蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）；但谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦血清酶活性的影響(U∕ml)

3 討論

3.1 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦生產(chǎn)性能的影響

對蝦飼料中魚粉用量很高，隨著魚粉資源的短缺，尋找魚粉的替代蛋白源已成為水產(chǎn)營養(yǎng)與飼料研究的熱點。水產(chǎn)動物對蛋白需求量高且對蛋白質(zhì)消化能力較弱，使其對蛋白原料的質(zhì)量要求很高。已有大量研究表明，與常規(guī)植物蛋白原料相比，酶解植物蛋白可以促進(jìn)鯽（Carassius aumtus）（劉文斌等，2007；Gui等，2010）、鯉（Cyprinus carpiovar Jian）（馮琳等，2008）、凡納濱對蝦（冷向軍等，2006）的生長和降低餌料系數(shù)，說明了酶解植物蛋白可以作為水產(chǎn)飼料中的一種優(yōu)質(zhì)氮源。研究結(jié)果顯示，適宜水平的酶解植物蛋白（2%～4%的富力肽）可部分地替代對蝦飼料中的進(jìn)口魚粉，不會影響對蝦的生長和飼料利用效率。表2結(jié)果進(jìn)一步表明，成活率并未隨酶解植物蛋白水平的變化而顯著變化，與劉文斌等（2007）和冷向軍等（2006）的研究結(jié)果一致。酶解植物蛋白是以優(yōu)質(zhì)的植物蛋白為原料，經(jīng)組合液態(tài)酶解生產(chǎn)的小肽產(chǎn)品，其符合水產(chǎn)動物的生理需求特點，可以作為水產(chǎn)飼料中魚粉的替代蛋白源。

本試驗結(jié)果顯示，當(dāng)飼料中添加6%～10%的酶解植物蛋白，對蝦的生長和飼料利用效率降低。與馮琳等（2008）在建鯉上的研究結(jié)果一致，但高水平的酶解植物蛋白導(dǎo)致水產(chǎn)動物生產(chǎn)性能下降，這可能與其自身的消化生理特點有關(guān)。一方面，動物的消化道需要充分鍛煉；另一方面，需要適當(dāng)補(bǔ)充小肽。因此，只有當(dāng)飼料中氨基酸、小肽和蛋白質(zhì)需要合理組合，才能使動物的生產(chǎn)潛力最大程度發(fā)揮，但對于不同動物其適宜的組合比例不同。

3.2 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響

血清葡萄糖濃度可以反映動物體內(nèi)糖代謝狀況，同時也是反映飼料營養(yǎng)是否適當(dāng)和肝臟機(jī)能是否良好的指標(biāo)（趙萬鵬等，2002）。本試驗結(jié)果顯示，添加2%～6%的酶解植物蛋白對血清葡萄糖濃度無顯著影響（P＞0.05），添加更高水平酶解蛋白時，血清葡萄糖濃度降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加適宜水平的酶解植物蛋白，可以保證水產(chǎn)動物體內(nèi)正常的糖代謝，不會造成肝臟代謝負(fù)擔(dān)。而血清甘油三酯含量的提高說明了體內(nèi)能量增加，細(xì)胞分裂和生長加速，甘油三酯可為新的細(xì)胞膜和細(xì)胞器提供脂類（駱作勇等，2007）。膽固醇不僅是皮質(zhì)類激素和性激素的前體，還能用于合成新的細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜等（沈同等，1996）。正常情況下，甘油三酯含量的升降往往伴隨著膽固醇的升降。本試驗結(jié)果顯示，2%～6%的酶解植物蛋白對血清甘油三脂和膽固醇含量無顯著影響，更高水平時二者的濃度降低。研究結(jié)果表明，添加適宜水平的酶解植物蛋白，可以保證水產(chǎn)動物體內(nèi)正常的脂肪代謝、細(xì)胞的分裂和生長發(fā)育。血清總蛋白含量反映動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)代謝狀況（胡俊茹等，2010）。本試驗結(jié)果顯示，隨著酶解植物蛋白水平的升高，血清總蛋白水平無顯著變化，但高水平有降低趨勢。高水平的酶解植物蛋白會降低血清葡萄糖、甘油三酯和膽固醇含量，即一定程度影響體內(nèi)脂肪和碳水化合物的代謝，這可能是高水平酶解植物蛋白導(dǎo)致對蝦生產(chǎn)性能下降的原因之一。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是廣泛存在于動物線粒體中重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用（楊義，2005）。在適宜的營養(yǎng)條件下，動物蛋白代謝保持穩(wěn)定，血清轉(zhuǎn)氨酶活性大小反映了氨基酸代謝強(qiáng)度的大小。表4結(jié)果顯示，使用2%～6%的酶解植物蛋白，可提高對蝦血清谷草和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，即增強(qiáng)了對蝦體內(nèi)氨基酸代謝的強(qiáng)度，這表明了酶解植物蛋白可以增強(qiáng)對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝，這也與蝦體組成中蛋白質(zhì)含量一定程度升高有關(guān)。

3.3 酶解植物蛋白對凡納濱對蝦非特異性免疫能力的影響

酚氧化酶系統(tǒng)是對蝦體內(nèi)重要的異物識別和防御系統(tǒng)，酚氧化酶催化生成的黑色素及黑化反應(yīng)的中間產(chǎn)物均具有細(xì)胞毒性或抗微生物功能，所以酚氧化酶系統(tǒng)激活對于維持甲殼動物體液的無菌性十分重要（Sritunyalucksana等，2000）。表5結(jié)果可見，添加2%～8%的酶解植物蛋白，可顯著提高對蝦血清酚氧化酶活性，即增強(qiáng)對蝦清除病原體的能力。超氧化物歧化酶（SOD）能催化超氧陰離子的歧化作用，產(chǎn)生過氧化氫和氧，是一種重要的抗氧化酶。SOD活性變化可反映對蝦的免疫狀態(tài)，衡量對蝦的機(jī)能健康狀況（趙紅霞等，2010）。結(jié)果表明，使用酶解植物蛋白后，對蝦血清SOD活性持續(xù)升高，即對蝦的免疫能力持續(xù)增強(qiáng)。結(jié)果表明，使用不同水平的酶解植物蛋白均可以增強(qiáng)對蝦的免疫能力。但對蝦的成活率并未隨酶解植物蛋白水平的升高而顯著提高，這與冷向軍等（2006）的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

酶解植物蛋白可以增強(qiáng)水產(chǎn)動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)代謝，促進(jìn)體蛋白沉積；酶解植物蛋白可以增強(qiáng)水產(chǎn)動物的免疫能力，提高疾病抵抗力；酶解植物蛋白具有小肽所特有的生理功能優(yōu)勢，但需與魚粉等蛋白質(zhì)原料合理組合，才能充分發(fā)揮其優(yōu)勢，激發(fā)動物的最大生產(chǎn)潛力；本試驗條件下以生產(chǎn)性能為標(biāo)識，酶解植物蛋白可以等量替代4%的進(jìn)口魚粉。