■楊家威 孫龍生 蔡春光 趙 躍 楊澤禹 叢 寧

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009;2.揚(yáng)州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇揚(yáng)州225101）

黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是目前主推淡水養(yǎng)殖品種。在相同養(yǎng)殖條件下，雄性黃顙魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)速度快30%左右，導(dǎo)致雌雄生長(zhǎng)速度和個(gè)體大小差異懸殊。劉漢勤等[1]采用性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育的方法生產(chǎn)出全雄黃顙魚(yú)（all-mallPelteobagrus fulvidraco），解決了商品魚(yú)規(guī)格不齊問(wèn)題，顯著提高了黃顙魚(yú)的產(chǎn)量和效益。近年來(lái)，人們圍繞黃顙魚(yú)消化生理，從發(fā)育階段、餌料來(lái)源、投喂頻率、酶動(dòng)力學(xué)等方面對(duì)黃顙魚(yú)消化酶活性開(kāi)展了相關(guān)研究。李芹等[2]研究了瓦氏黃顙魚(yú)發(fā)育過(guò)程中酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)不同酶比活力變化模式不同，但主要消化酶活性均隨著生長(zhǎng)而變化顯著；李芹等[3]報(bào)道，投喂活餌料組瓦氏黃顙魚(yú)蛋白酶活性高于人工飼料組，而脂肪酶和淀粉酶活性卻相反；王武等[4]研究表明，投喂頻率刺激對(duì)黃顙魚(yú)腸蛋白酶活性有顯著影響，其活性隨投喂頻率的增加而顯著降低；余濤等[5]對(duì)黃顙魚(yú)消化器官蛋白酶和淀粉酶活性進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果顯示腸是黃顙魚(yú)主要的消化器官之一，其蛋白酶最適pH值為7.0，且中腸的蛋白酶和淀粉酶活性最強(qiáng)。有關(guān)黃顙魚(yú)攝食前后消化酶活性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在比較攝食前后全雄黃顙魚(yú)不同消化器官（肝胰腺、胃、腸道）消化酶活性的高低，探討全雄黃顙魚(yú)攝食前后不同時(shí)間消化酶活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為了解全雄黃顙魚(yú)消化生理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

全雄黃顙魚(yú)幼魚(yú)由高郵董氏特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供。試驗(yàn)前選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重（10.11±0.12）g的幼魚(yú)150尾，隨機(jī)分配到3個(gè)水族箱中（100 cm×40 cm×50 cm），每個(gè)水族箱50尾。試驗(yàn)采用微循環(huán)水流，間隙式增氧；溫度控制在26～28℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料按配比定量后混合，加水揉勻，用F-26型顆粒飼料擠條機(jī)加工成粒徑為2 mm硬顆粒飼料，自然風(fēng)干后，密封保存于-20℃冰箱中備用。

試驗(yàn)魚(yú)每天投喂2次（7:00和17:00），馴養(yǎng)3周。正式試驗(yàn)前，試驗(yàn)魚(yú)先饑餓28 h，取樣后立即投喂，并以此時(shí)間作為0 h開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別于0、1、2、4、6、8 h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，每組6個(gè)重復(fù)，樣品置于冰盤解剖，分別采集肝胰腺、腸和胃，迅速置于液氮凍存，-70℃保存以備消化酶活性測(cè)定。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 消化酶活性的測(cè)定

待測(cè)組織樣品分析前于冰上解凍，除去內(nèi)容物，用雙蒸水沖洗，濾紙吸干，稱重后與預(yù)冷的去離子水按1∶9質(zhì)量體積比稀釋，冰浴中用高速組織勻漿機(jī)勻漿，勻漿液4 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液作為粗酶液。

淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，具體方法參見(jiàn)試劑盒所附說(shuō)明書(shū)。

組織淀粉酶活性單位定義：組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活性單位。

組織脂肪酶活性單位定義：在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1個(gè)酶活性單位。

組織胃蛋白酶活性單位定義：每毫克組織蛋白37℃每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個(gè)酶活性單位。

組織胰蛋白酶活性單位定義：在pH值8.0、37℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為1個(gè)酶活性單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用EXCEL記錄數(shù)據(jù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 for Windows軟件分析，以不同時(shí)間點(diǎn)為影響因素，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way Analysis，ANOVA)，多重比較采用Duncan's法，顯著水平設(shè)定為P＜0.05。分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（Means±SD）。

2 結(jié)果

2.1 攝食前后全雄黃顙魚(yú)淀粉酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時(shí)間點(diǎn)全雄黃顙魚(yú)消化道組織淀粉酶活性的變化規(guī)律見(jiàn)圖1和表2。

淀粉酶活性以腸道最強(qiáng)，在攝食后0～8 h內(nèi)，其活性分別是肝胰腺的10～30倍、胃的10～200倍，其高低順序?yàn)槟c＞肝胰腺＞胃。肝胰腺淀粉酶活性在攝食后1 h[(37.18±2.35)U/mg protein]高于攝食前[(7.39±0.50)U/mg protein]（P＜0.01），攝食后4～8 h降到最低；腸淀粉酶活性攝食后1～2 h較攝食前高[(196.40±19.87)U/mg protein]（P＜0.01），其最高值出現(xiàn)在攝食后 2 h[(374.17±0.05)U/mg protein]，除與攝食后 1 h之間差異不顯著（P＞0.05），均極顯著高于其它各時(shí)間點(diǎn)（P＜0.01）；胃淀粉酶活性則是攝食后極顯著低于攝食前[(11.03±1.73)U/mg protein]（P＜0.01），且攝食后1～8 h其活力一直維持在較低水平（P＞0.05）。

圖1 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)淀粉酶活性的影響

表2 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)淀粉酶活性的影響(U/mg)

2.2 攝食前后全雄黃顙魚(yú)脂肪酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時(shí)間點(diǎn)全雄黃顙魚(yú)消化道組織脂肪酶活性的變化規(guī)律見(jiàn)圖2和表3。

圖2 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)脂肪酶活性的影響

脂肪酶活性高低順序?yàn)槟c＞肝胰腺＞胃，但肝胰腺及腸脂肪酶活性攝食后各時(shí)間段與攝食前比較差異不顯著（P＞0.05）。相反，胃脂肪酶活性在攝食2 h明顯高于攝食0～1 h（P＜0.05），攝食后4～6h 降至較低水平（P＞0.05），攝食后8 h有升高的趨勢(shì)，但與攝食后2 h之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 攝食前后全雄黃顙魚(yú)胃蛋白酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時(shí)間點(diǎn)全雄黃顙魚(yú)消化道組織胃蛋白活性的變化規(guī)律見(jiàn)圖3和表4。

胃蛋白酶主要存在于黃顙魚(yú)的胃組織、肝胰腺和腸道組織中，胃蛋白酶活性在攝食后始終維持在低水平，且胃組織中胃蛋白酶活性在各時(shí)間點(diǎn)均高于肝胰腺和腸。胃組織中胃蛋白酶活性在攝食后1 h[(3.71±0.31)U/mg protein]與攝食前[(4.22±0.52)U/mg]有顯著性差異（P＜0.05），攝食后2～4 h略有升高，且攝食后6～8 h維持在較低水平。

表3 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)脂肪酶活性的影響(U/g)

圖3 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)胃蛋白酶活性的影響

2.4 攝食前后全雄黃顙魚(yú)胰蛋白酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時(shí)間點(diǎn)全雄黃顙魚(yú)消化道組織胰蛋白酶活性的變化規(guī)律見(jiàn)圖4和表5。

圖4 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)胰蛋白酶活性的影響

胰蛋白酶主要存在于肝胰腺和腸道組織，試驗(yàn)中未檢測(cè)出胃組織中存在胰蛋白酶活性，且胰蛋白酶活性均是在攝食前最高，攝食后快速下降。肝胰腺胰蛋白酶活性在攝食后1 h[(91.62±10.33)U/mg]與攝食前[(402.03±64.41)U/mg]有極顯著性差異（P＜0.01），隨著攝食后時(shí)間的延長(zhǎng)，胰蛋白酶活性逐漸降低，在攝食后6 h降至最低[(43.76±10.23)U/mg]，但在攝食8 h[(110.76±15.56)U/mg]有逐漸升高的趨勢(shì)；腸胰蛋白酶活性攝食前后變化規(guī)律與肝胰腺相似。

表4 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)胃蛋白酶活性的影響(U/mg)

表5 攝食對(duì)全雄黃顙魚(yú)胰蛋白酶活性的影響(U/mg)

3 討論

魚(yú)類消化酶的分泌與攝食活動(dòng)密切相關(guān)，攝食后消化酶的分泌既受到食物的影響，同時(shí)也受到魚(yú)體自身生理特點(diǎn)的約束與影響[6]；消化酶的分泌過(guò)程存在多種調(diào)節(jié)機(jī)制，但攝食食物是主要的誘導(dǎo)因素。王立波等[7]研究攝食對(duì)懷頭鲇（Silurus soldatovi）胃腸道消化酶活性影響發(fā)現(xiàn)，懷頭鲇胃蛋白酶活性在攝食后先降低后快速上升，而腸蛋白酶活性一直保持上升的趨勢(shì)，他認(rèn)為蛋白酶活性在攝食后先下降后升高是肉食性魚(yú)類長(zhǎng)期以來(lái)形成的，即在攝食前就在消化器官中儲(chǔ)備一定的酶，以便更有效地利用飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本試驗(yàn)測(cè)定了全雄黃顙魚(yú)肝胰腺、胃及腸道組織的淀粉酶活性、脂肪酶活性、胃蛋白酶活性和胰蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)除腸道淀粉酶活性在攝食后升高，其它消化酶的活力在攝食后均有不同程度的降低。酶活性先下降后升高的現(xiàn)象表明，攝食前組織中存在酶的基礎(chǔ)分泌現(xiàn)象，隨后酶活性持續(xù)緩慢下降說(shuō)明組織分泌酶的量在減少，而此時(shí)食糜中酶的活性應(yīng)較高。可以看出，攝食刺激對(duì)全雄黃顙魚(yú)消化組織相關(guān)酶的分泌并不完全是增強(qiáng)，具有一定的組織差異性，其深層原因有待進(jìn)一步研究。

研究顯示，魚(yú)類在進(jìn)化過(guò)程中唾液腺逐漸退化，淀粉酶主要由肝臟產(chǎn)生。周景祥等[8]試驗(yàn)證明，魚(yú)類淀粉酶主要由肝胰腺分泌產(chǎn)生，但倪壽文等[9]證明腸道也可以產(chǎn)生淀粉酶，且具有較高的活性。本試驗(yàn)中在3種消化組織中均能檢測(cè)到淀粉酶存在，這與孫翰昌等[10]、王武等[11]研究結(jié)果相一致；魚(yú)類胃淀粉酶活性較低，且不隨飼料成分的改變而變化[12-13]，再者胃內(nèi)酸性較強(qiáng)，因此可以認(rèn)為淀粉酶在胃內(nèi)的消化作用微乎其微。黃顙魚(yú)攝食前后，腸淀粉酶活性均高于肝胰腺和胃，在攝食后不同時(shí)間段分別是肝胰腺的10～30倍、胃的10～200倍，腸淀粉酶活性最高值出現(xiàn)在攝食后1～2 h，由此可以推測(cè)黃顙魚(yú)腸道能夠產(chǎn)生并分泌淀粉酶，且對(duì)淀粉具有較高的利用能力，此外腸道對(duì)淀粉的消化主要是在攝食后的1～2 h。

胃消化作用主要是對(duì)飼料中的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分解，胃蛋白酶只有在強(qiáng)酸環(huán)境下才能分解蛋白質(zhì)，因此在3種組織中胃組織中胃蛋白酶活性遠(yuǎn)高于肝和腸；腸中能夠檢測(cè)到胃蛋白酶活性，但其變化規(guī)律與胃組織一致，分析原因可能是胃蛋白酶隨食糜進(jìn)入腸道所致。

攝食活動(dòng)影響魚(yú)類消化酶的分泌，而食物的組成也是影響魚(yú)類消化酶分泌的主要因素[14]。目前魚(yú)類飼料蛋白源中植物類蛋白較多，當(dāng)豆粕和菜粕類原料作為飼料蛋白源使用時(shí)，胰蛋白酶的分泌會(huì)受到抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響。田麗霞等[15]比較了魚(yú)粉和黃豆餅為蛋白源時(shí)草魚(yú)腸蛋白酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)魚(yú)粉組在攝食后胰蛋白酶活性持續(xù)上升，而黃豆餅組在攝食0～5 h內(nèi)急劇下降，10 h上升。她認(rèn)為，黃豆餅組腸組織蛋白酶活性在攝食后先有一個(gè)下降過(guò)程，這很可能是由于黃豆餅中含有抗胰蛋白酶抑制了腸內(nèi)胰蛋白酶的活性。在本試驗(yàn)中，黃顙魚(yú)肝胰腺和腸道組織中的胰蛋白酶活性在攝食后急劇降低，在6 h時(shí)降至最低，隨后逐漸回升，這與田麗霞等人的研究結(jié)果一致。分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)飼料原料中膨化大豆、豆粕及菜粕等占到30%，攝食后的胰蛋白酶活性急劇下降可能與飼料中抗胰蛋白酶因子有關(guān)。此外，胰蛋白酶活性在攝食后急劇下降也可能與食物刺激帶來(lái)的消化器官內(nèi)儲(chǔ)酶大量分泌有關(guān)。Kawis.,Ikeda[16]給鯉魚(yú)投喂市售的顆粒飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝胰腺蛋白酶活性在2 h后達(dá)到最低，他推測(cè)肝胰腺和腸道分泌細(xì)胞不斷形成的消化酶積累在分泌細(xì)胞或腺泡腔內(nèi)，魚(yú)類的攝食以及食團(tuán)對(duì)腸道的刺激引起消化組織內(nèi)積累的消化酶排入消化道，這導(dǎo)致消化組織的酶活性在攝食后降低，而此時(shí)腸內(nèi)容物酶活性可能升高。試驗(yàn)中未對(duì)腸道內(nèi)容物胰蛋白酶活性進(jìn)行檢測(cè)，有關(guān)因食物刺激而導(dǎo)致的組織胰蛋白酶活性降低這一情況有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)各消化酶活性是在一次性攝食后測(cè)定的，而影響消化酶活性的因素很多，攝食量、飼料蛋白質(zhì)水平以及日常投喂頻率等均會(huì)影響攝食前后酶活性的高低，有關(guān)全雄黃顙魚(yú)消化器官分泌消化酶的生理機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

全雄黃顙魚(yú)攝食前后消化道不同消化酶活性存在時(shí)序變化和組織差異性。