■ 雷亞君 唐亞麗 盧立新

（1.江南大學機械工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學中國包裝總公司食品包裝技術與安全重點實驗室，江蘇無錫214122；3.江蘇省食品先進制造技術重點實驗室，江蘇無錫214122）

我國擁有非常廣闊的水域，水產(chǎn)品資源豐富且其中富含膠原蛋白，但水產(chǎn)品的加工研究滯后。膠原蛋白是動物體內(nèi)最多的蛋白質(zhì)，良好的生物相容性及可生物降解性及低抗原性[1]，使之被廣泛地用于食品及生物醫(yī)學材料等領域中。由膠原蛋白水解得到的膠原肽有許多生理活性功能，例如ACE抑制肽、抗腫瘤肽以及抗氧化肽等[2]，所以以水產(chǎn)品為加工原料制備膠原肽有廣闊的前景。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting I enzyme,ACE)能調(diào)節(jié)血壓，當其受到抑制時，血壓就會降低。Ferreira（1965）[3]在蛇的毒液中得到了ACE抑制肽,從此開啟了ACE抑制肽應用的篇章。通過動物（高血壓大鼠）和臨床試驗發(fā)現(xiàn)，口服或是靜脈注射ACE抑制肽降血壓效果都很好[4-7]。用于臨床的合成ACE抑制劑易引起多種副作用，來自天然的ACE抑制肽則安全可靠,藥物毒副作用小,且易吸收，是人們研究的熱點。

ACE抑制肽主要通過酶法制得，然后用凝膠、反相色譜等方法分離純化。由于有ACE抑制活性的肽類大多是寡肽，寡肽一般由2～6個氨基酸組成，分子量段一般在1 000 Da以下，所以要盡可能提高寡肽產(chǎn)物的含量。本試驗考察了酶解產(chǎn)物的肽得率、相對分子質(zhì)量分布和ACE抑制活性，比較四種酶對魚皮膠原蛋白的作用效果，并選出最優(yōu)酶種，得到最佳酶解條件。

蛋白酶是一類催化肽鍵水解的酶，它具有專一性，酶種不同，其酶的化學特性是不同的，導致某種蛋白酶可能只對某些肽鍵作用[8]。本試驗用下面四種酶對魚皮膠原蛋白水解：①A.S.1398蛋白酶，是從枯草桿菌中得來的食品級中性蛋白酶[9]，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)；②Alcalase 2.4 L，NOVO酶制劑公司的產(chǎn)品，食品級，已被廣泛用于生物技術領域[10-13]；③Protease N，Amano酶制劑公司的產(chǎn)品，有較高的水解蛋白質(zhì)的能力，其作用得到含 3～5個氨基酸短肽的酶解產(chǎn)物比例較高；④木瓜蛋白酶，從木瓜胚乳中得到，屬于巰基蛋白酶,有較寬的底物特異性，能使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鏈-CO-NH-斷裂，使之生成小分子量的多肽類，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)[14]。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料和主要試劑

魚皮膠原蛋白(試驗室制備)、Protease N（日本天野酶制品株式會社）、A.S.1398中性蛋白酶（無錫杰能科酶制劑公司）、Alcalase 2.4 L[丹麥諾維信(NOVO)公司]、木瓜蛋白酶(上海生物試劑公司 )、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)（美國Sigma公司）。

1.2 酶解魚皮膠原蛋白

向恒溫酶反應器中加入魚皮膠原蛋白和水，攪拌，使之混勻。向反應器中加酶，通過 0.5 mol/l NaOH保持反應體系的pH值，用pH-stat法檢測水解度。在反應結(jié)束后，用沸水浴滅酶15 min。在冷卻后離心30 min，取上清液，經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥。

1.3 蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)的測定

采用pH-stat法檢測水解度[15]。

1.4 相對分子質(zhì)量分布的測定

儀器：Waters 600高效液相色譜儀；色譜柱：TSK-gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；檢測：UV220 nm；流速：0.5 ml/min；柱溫：30℃。將干燥后的魚皮酶解產(chǎn)物配成0.5 mg/ml的濃度；進樣體積：20 μl。

1.5 測定酶解產(chǎn)物ACE抑制活性

采用色譜法測定ACE的活性，參照 Shu Hua Xia[10]中的方法。

色譜條件：HPLC系，美國Waters公司；色譜柱：Sun-FireTM C18 ODS（150 mm×4.6 mm），美國 Waters公司；流速：1.0 ml/min；檢測波長：228 nm；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；流動相：12%乙腈（含 0.05%乙酸）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶對魚皮膠原蛋白的水解

在酶與底物濃度比([E]/[S])為相同（3 000 U/g）的情況下，通過肽得率比較幾種蛋白酶在各自最適的情況下對魚皮膠原的酶解效果(見表1)。

表1 幾種酶對魚皮膠原酶解效果比較

由表1可知，水解魚皮膠原肽得率最高的是Protease N和A.S.1398，其酶解效果優(yōu)于另外兩種蛋白酶，所以選擇這兩種酶水解魚皮膠原。

2.2 酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量

酶的作用位點是不同的，所以即使在水解度條件相同的情況下，其產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布也不同。蛋白質(zhì)可以通過兩種形式被吸收，即肽和氨基酸。肽與游離氨基酸運輸方式不同，肽的吸收高效迅速，特別是寡肽[11-12]；而高滲透性的游離氨基酸易導致腹瀉[13]。肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目對活性有很大的影響[16-17]。因此，相對分子質(zhì)量的含量是酶解產(chǎn)物需要考慮的指標。

表2所示是當水解度為16%時，兩種酶對魚皮膠原蛋白酶解作用產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布和游離氨基酸的含量。由表2可知，當水解度相同時，A.S.1398的酶解產(chǎn)物中，分子量800～150 Da的比例達到72.36%，而分子量小于150 Da的僅占0.94%，所以寡肽較多，游離氨基酸較少。故得出，A.S.1398對魚皮膠原水解的作用效果較好。

表2 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布和游離氨基酸的含量

2.3 酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性

測定兩種酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，兩種酶解產(chǎn)物濃度均為1.5 mg/ml(見圖 1)。

圖1 兩種酶解產(chǎn)物的ACE抑制率與水解度的關系

由圖1可知，水解度相同時，A.S.1398酶解產(chǎn)物的ACE活性較高，且隨著水解度(DH)升高而增加，可能是由于酶對底物的特異性以及作用位點的不同所造成的。一般情況下，較小分子量的肽有ACE抑制活性，這與表2的結(jié)果也是一致的。

2.4 影響A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的因素

2.4.1 底物濃度的影響

底物濃度對酶解反應有著重要的影響，酶與底物的結(jié)合隨著底物濃度的增加而增多，從而提高反應速率。在酶解溫度為50℃，6%的A.S.1398加入量，在pH值為7.0情況下，觀察底物濃度對水解度的影響(見圖2)。

圖2 不同底物濃度對A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

由圖2可知，在3個底物濃度中，A.S.1398于濃度為5%時對魚皮膠原的水解作用是最好的，底物濃度增加到7%時，水解度反而下降了。這說明底物抑制現(xiàn)象會在魚皮膠原蛋白的酶解過程中產(chǎn)生，所以較適宜的底物濃度為5%。

2.4.2 酶解溫度的影響

在底物濃度[S]為5%，酶與底物濃度比([E]/[S])為6%，且pH值為7.0的情況下，研究酶解溫度對水解度的影響(如圖 3)。

圖3 不同酶解溫度對A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

圖3中顯示，3個酶解溫度中，A.S.1398于50℃時對魚皮膠原的水解效果是最好的。隨著酶解時間的增長，水解度顯著升高。但在55℃時，DH數(shù)值反而降低了。所以，A.S.1398酶解魚皮膠原的較適宜溫度在50℃左右。

2.4.3 pH值的影響

pH值的影響是多重的，不僅對酶的穩(wěn)定性，對酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物也有作用。在底物濃度為5%的情況下，加酶量為6%，酶解溫度為50℃，觀察此時不同pH值對水解度的影響(見圖4)。

圖4 不同pH值對A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

由圖4可知，在3個pH值中，A.S.1398于pH值在6.5時對魚皮膠原的水解作用是最好的，水解度隨著反應液的pH值的升高而下降。所以，pH值6.5是A.S.1398水解魚皮膠原蛋白最適宜的pH值。

2.5 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的組成分析

由以上確定最佳酶種為A.S.1398，最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度為50℃，底物濃度為5%，pH值為6.5。在此情況下對魚皮膠原作用，其酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布見表3。由表3可知，分子量為800～150 Da所占比例高達72.48%，所以酶解產(chǎn)物中含寡肽較多。

表3 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布

3 結(jié)論

在本試驗中，考察了酶解產(chǎn)物的肽得率、相對分子質(zhì)量分布和ACE抑制活性這三個方面。由試驗得出，在四種酶中，A.S.1398是水解魚皮膠原蛋白的最佳酶種，其最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50℃，底物濃度5%，pH值6.5，此時得到ACE抑制性較好的膠原蛋白肽。與合成藥物相比，天然來源的ACE抑制活性肽安全可靠，藥物副作用小，是人們研究的熱點。今后應進一步對魚皮膠原蛋白ACE抑制肽進行分離純化并研究其作用機理，為漁業(yè)資源的綜合開發(fā)利用提供技術支持。