■王巍杰 賈瑞雪 常麗新

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物資源十分豐富，作物秸稈中65%～80%干物質(zhì)能夠向動(dòng)物提供能量[1]，秸稈飼料是發(fā)展畜牧業(yè)的重要飼料資源[2]，但秸稈中粗纖維含量高，飼料適口性差，影響動(dòng)物的正常吸收消化[3]。本文研究采用白腐真菌發(fā)酵制備玉米秸稈飼料的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈：清洗、干燥、粉碎。

白腐菌：由河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯培養(yǎng)基無瓊脂)。

葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀和濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子天平；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱；8HZ-92A型氣浴恒溫振蕩器；康達(dá)多功能食品粉碎機(jī)KDF-2311型。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測(cè)定

白腐真菌降解秸稈纖維素活力的測(cè)定方法采用DNS法，按費(fèi)尚芬等[4]方法測(cè)定酶活。

1.3.2 產(chǎn)糖量測(cè)定方法

還原糖含量測(cè)定采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[5],在0.2～1.2 mg/ml范圍內(nèi)，葡萄糖線性方程Y=0.775X-0.054 7(n=6，r=0.999 7)。

1.3.3 含氮量和粗纖維測(cè)定方法

采用凱氏定氮方法；粗纖維采用酸性洗滌劑法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

準(zhǔn)確稱取4%磷酸氫二鉀、5%氯化鈉，添加適量固液比玉米秸稈，接種相同適量白腐真菌液，控制相同溫度和pH值，分別測(cè)定不同時(shí)間24、48、72、96、120、144 h白腐真菌酶活力，試驗(yàn)結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示：在發(fā)酵時(shí)間24～144 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，白腐真菌酶活逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)至96 h時(shí)，酶活達(dá)到最大值，隨后隨著發(fā)酵時(shí)間的逐漸增長(zhǎng)纖維素酶活逐漸降低,因此,確定正交試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間為72、96 h和120 h。

2.2 溫度對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

準(zhǔn)確稱取4%磷酸氫二鉀、5%氯化鈉，添加適量固液比玉米秸稈，接種相同適宜白腐真菌液和pH值，分別在20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h測(cè)定白腐真菌酶活力，試驗(yàn)結(jié)果見圖2，在溫度20～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度逐漸增加，酶活逐漸增加，當(dāng)溫度30℃時(shí)酶活最大，為12.23 U/g,隨后隨著溫度升高，酶活逐漸降低，因此，確定正交試驗(yàn)發(fā)酵溫度為25、30℃和35℃。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

圖2 溫度對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

2.3 pH值對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

準(zhǔn)確稱取4%磷酸氫二鉀、5%氯化鈉，添加適量固液比玉米秸稈，接種相同適量白腐真菌液，分別在不同pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0恒溫30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h測(cè)定酶活力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，pH值在6.5～9.0范圍內(nèi)，隨著pH值增加白腐真菌酶活呈逐漸上升趨勢(shì)，pH值8.0酶活最大為11.97 U/g，隨后酶活逐漸降低，確定正交試驗(yàn)pH值為7.5、8.0和8.5。

2.4 固液比對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

準(zhǔn)確稱取4%磷酸氫二鉀、5%氯化鈉，接種相同適量白腐真菌液，分別測(cè)定不同玉米秸稈固液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30在pH值8.0恒溫30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h的酶活力，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，在固液比1∶10～1∶30范圍內(nèi)，隨著固液比的增加，酶活呈增加趨勢(shì)，固液比1∶20時(shí)酶活最大，為8.32 U/g,隨后酶活逐漸降低，因此，確定正交試驗(yàn)固液比為1∶15、1∶20和1∶25。

圖3 pH值對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

圖4 固液比對(duì)白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈酶活的影響

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化白腐真菌發(fā)酵玉米秸稈制備飼料的工藝

設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以白腐真菌酶活為考察指標(biāo)，考察時(shí)間、溫度、pH值和固液比對(duì)白腐真菌降解纖維素制備秸稈飼料的影響，因素與水平、正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表1～表3。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2和表3可知，以酶活為考察指標(biāo)，白腐真菌降解秸稈纖維素的影響程度順序?yàn)锽＞A＞D＞C，其中B影響顯著，最佳組合為A1B2C3D1，即最佳條件：發(fā)酵時(shí)間72 h、溫度30℃、pH值8.5和固液比1∶15。

2.6 白腐真菌發(fā)酵對(duì)玉米秸稈成分的影響

在2.5節(jié)確定的最佳工藝條件下制備玉米秸稈飼料，分別測(cè)定發(fā)酵前后纖維素含量、還原糖含量和蛋白含量，試驗(yàn)結(jié)果見表4，分析表4可知，還原糖含量增加13.78個(gè)百分點(diǎn)，粗蛋白含量增加3.98個(gè)百分點(diǎn)，粗纖維含量降低13.91個(gè)百分點(diǎn)。

表4 白腐真菌發(fā)酵對(duì)玉米秸稈成分的影響

3 結(jié)論

采用白腐真菌降解玉米秸稈制備飼料，以降解纖維素酶活為考察指標(biāo)，通過L93(4)正交試驗(yàn)確定玉米秸稈飼料發(fā)酵最佳工藝條件發(fā)酵時(shí)間72 h、溫度30℃、pH值8.5和固液比1∶15。秸稈飼料中粗纖維還原糖含量增加13.77個(gè)百分點(diǎn)，粗蛋白含量增加3.98個(gè)百分點(diǎn)，粗纖維含量降低13.91個(gè)百分點(diǎn)。