■ 盧玉飛 張雪元 馬婷婷 李 華

（1.濟寧和實生物科技有限公司，山東濟寧273517；2.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009）

反芻動物飼糧中蛋白質(zhì)或氨基酸在瘤胃內(nèi)部分被降解，過瘤胃的氨基酸和微生物蛋白才在小腸內(nèi)被吸收和轉(zhuǎn)化。小腸吸收的氨基酸對于奶牛進行維持生長、繁殖和泌乳等生命活動極為重要。對于生長、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶或乳蛋白合成而言，蛋氨酸（Met）和賴氨酸可能是兩種首要的限制性氨基酸（Chaiupa，1975），且兩者的限制性順序視飼糧的來源不同而決定，即在過瘤胃蛋白中的相對含量（Schwab等，1976）。若飼喂動物的飼糧中含Met相對較少或賴氨酸相對較多，則Met被認為是斷奶犢牛（Donahue等，1985）、生長牛（Robert等，1999）和泌乳牛（Armentano等，1997）的第一限制性氨基酸。尤其對于生長牛的氮沉積而言，Met是微生物蛋白中的第一限制性氨基酸（Richardson等，1978；Titgemeyer等，1990b）。所以，如何提高反芻動物過瘤胃蛋氨酸的含量和Met在小腸中的吸收率，是動物營養(yǎng)學(xué)家們研究的熱點。

張萍（2001）研究發(fā)現(xiàn)，奶牛代謝蛋白中所需Met的確定含量為2.06%。補充過瘤胃蛋氨酸的方法有多種，最直接的方法有提高飼糧中含Met高的原料的含量，補充降解率低的天然過瘤胃蛋白飼料，或根據(jù)小腸氨基酸平衡狀況，將不同高蛋白飼料組合搭配。但這些方法在提高過瘤胃蛋氨酸含量的同時，不但使過量的蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解，瘤胃內(nèi)氨氮濃度過高，蛋白質(zhì)資源浪費，而且絕大部分會在瘤胃內(nèi)被微生物降解而到達小腸的氨基酸很少。因此人們研究的重點轉(zhuǎn)移到對Met進行過瘤胃保護性處理（NRC，2001），以增加小腸中Met的數(shù)量，提高吸收率，從而克服必需氨基酸短缺帶來的氨基酸之間的不平衡，提高反芻動物的生產(chǎn)性能。目前過瘤胃保護性氨基酸主要有物理包被和化學(xué)保護方法，但物理包被存在過度保護或保護不夠等缺點（謝實勇等，2003），因此人們關(guān)注的重點轉(zhuǎn)移到化學(xué)保護方面，化學(xué)性保護主要形式是形成蛋氨酸的金屬螯合物或絡(luò)合物、蛋氨酸類似物及其鈣鹽（MHA-Ca）或N-羥甲基蛋氨酸鈣（NHMM-Ca）。

1 過瘤胃蛋氨酸的主要類型

1.1 蛋氨酸金屬絡(luò)（螯）合物特點及過瘤胃率

蛋氨酸類金屬螯合物主要有蛋氨酸鋅（Met-Zn）、蛋氨酸錳、蛋氨酸銅和蛋氨酸鐵。由于Met-Zn適中的化學(xué)穩(wěn)定性、抗干擾、過瘤胃效果好和生物學(xué)效價高等特點(Rojas等，1996)，Met-Zn被認為是蛋氨酸金屬螯合物或化合物中最有應(yīng)用價值的。產(chǎn)品為白色固體粉末，流動性較好，具有蛋氨酸特有氣味。Met-Zn是Met與無機鋅鹽通過化合反應(yīng)按照1∶1或2∶1的摩爾比在一定的條件下生成的有機鋅類物質(zhì)，配位鍵與化合物形成一個或兩個五元環(huán)，五元環(huán)結(jié)構(gòu)中，各鍵之間的張力是環(huán)狀化合物中最小的，實驗制備步驟如圖1（于桂生，2005）。蛋氨酸與鋅合成摩爾比是2∶1時，蛋氨酸含量為49.38%，摩爾比為1∶1時，蛋氨酸含量為81.94%。金屬離子和蛋氨酸螯合后形成雙重營養(yǎng)的新型飼料添加劑，不僅為動物體提供微量元素，還能提供反芻動物缺乏最具限制性的蛋氨酸。

圖1 蛋氨酸鋅制備步驟

因其摩爾比和生產(chǎn)工藝不同等，產(chǎn)品的螯合率或絡(luò)合強度有較大差異（30%到90%多不等），所以過瘤胃率差異也較大（黃恒新，2010）。梁建光等（2008）選取了7個國內(nèi)外具有代表性的有機鋅源產(chǎn)品，其中Met-Zn 1個，鋅蛋白鹽2個（ZnPro A～B），復(fù)合氨基酸鋅3個（ZnAA A～C），甘氨酸鋅（Gly-Zn）1個。不同絡(luò)合強度有機鋅在模擬瘤胃環(huán)境下是穩(wěn)定的，過瘤胃率分別在92%以上，其中又以強絡(luò)合強度有機鋅（Gly-Zn）為最好（99.55%），弱絡(luò)合強度有機鋅（Met-Zn）次之(94.85%)，中絡(luò)合強度有機鋅(92.16%)相對最低。目前認為是Met與可溶性的鋅鹽（Zn2+）的摩爾比為2∶1所形成的化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定好，因為其結(jié)構(gòu)式是以Zn為中心原子而形成的兩個熬環(huán)結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)對稱，不易受飼料或瘤胃內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，能以螯合小肽的形式被吸收利用（黃恒鋅，2010）。Heinrichs等（1983）認為Met-Zn中的蛋氨酸在瘤胃中很大程度上不被瘤胃微生物降解，從而使蛋氨酸能夠進入小腸被吸收，并且相比于體外已發(fā)現(xiàn)的其它抗氧化劑（葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅、硫酸鋅和氧化鋅等）和自由基清除劑，Met-Zn可減弱氧自由基的生化活性（Bagchi等，1997）。

1.2 N-羥甲基蛋氨酸鈣

N-羥甲基蛋氨酸鈣(N-HMM-Ca)是Met的衍生物，化學(xué)名N-羥甲基-甲硫基丁酸鈣，產(chǎn)品為白色粉末，具有良好的流動性，Met含量大于67.6%。工業(yè)生產(chǎn)以DL-Met為原料，經(jīng)過羥甲基化和與無機鈣鹽反應(yīng)成鹽，后經(jīng)結(jié)晶、離心、干燥并粉碎后的產(chǎn)品。蛋氨酸的α-NH2被羥甲基化為-NHCH2OH，實驗室制備步驟如圖2。

圖2 N-羥甲基蛋氨酸鈣制備步驟

段紅偉（2000）通過體外模擬唾液、瘤胃和真胃的體外溶解性試驗，發(fā)現(xiàn)人工唾液環(huán)境（pH=8.14）1 h的溶解率＜5.6%；在人工瘤胃環(huán)境中（5.0≤pH≤7.0），當(dāng)5.5≤pH＜6時，N-HMM-Ca的溶解率變化平穩(wěn)，2 h內(nèi)的溶解率小于65%，當(dāng)pH≥6.5時，2 h內(nèi)的保護率＞60%，具有較好的穩(wěn)定性；在人工真胃環(huán)境中（pH=2.9）時，可迅速釋放，1 h內(nèi)全部溶解，保護率為100%。N-HMM-Ca具有較好的過瘤胃性，投放瘤胃3 h后即可通過瘤胃，表現(xiàn)了N-HMM-Ca作為反芻家畜過瘤胃保護性蛋氨酸飼糧添加劑的良好特性(段紅偉,2000)。Hegedus等（1995）在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同的氮源，瘤胃體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)微生物攝入Met時表現(xiàn)出最大的生長速率，而DL-S-甲基-蛋氨酸锍鹽鹽酸鹽和N-HMMCa次之。Buttery等（1977）試驗表明，通過體內(nèi)消化6 h檢測終產(chǎn)物甲硫醇，N-HMM-Ca在被評價的幾種化學(xué)合成的瘤胃保護性蛋氨酸中是最穩(wěn)定的。這些研究都表明N-HMM-Ca不僅能改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，避免瘤胃內(nèi)脫氨基，而且在過瘤胃后釋放率高，吸收迅速，體內(nèi)代謝率好，顯示出了用于反芻家畜的良好前景。

1.3 蛋氨酸羥基類似物及其鈣鹽

液態(tài)蛋氨酸羥基類似物(HMB)是褐色或棕色黏稠液體，有硫基的特殊氣味，溶于水。羥基蛋氨酸鈣(MHA-Ca)化學(xué)名為2-羥基-4-甲硫基丁酸鈣鹽。Met含量約為84%，產(chǎn)品為淺灰色粉末顆粒，可溶于水。Met中α-NH2被-OH代替，蛋氨酸羥基類似物的固態(tài)形式，是由液態(tài)蛋氨酸羥基類似物與氧氧化鈣或氧化鈣中和，經(jīng)離心、干燥和粉碎后制得，產(chǎn)品合成路線如圖3（徐宏斌等，2009）。

圖3 羥基蛋氨酸鈣制備步驟

研究報道，蛋氨酸羥基類似物及其鈣鹽大約有39.5%能避開奶牛瘤胃內(nèi)的降解，并且降解率不受其種類和添加量的影響，在瓣胃和十二指腸的吸收率分別為17.6%和22%（Koening等，2002）。

2 過瘤胃蛋氨酸的吸收機制

Met具有旋光性，分為L型和D型，L型易被動物腸壁吸收。但因其工業(yè)生產(chǎn)用的是DL-Met為原料來源，而動物體只能利用L-Met合成蛋白質(zhì)，所以過瘤胃保護性D-Met在動物體內(nèi)須先轉(zhuǎn)化為L-Met。

Met-Zn的吸收機制尚未清楚，有研究報道，Met-Zn因是具有兩個螯環(huán)的螯合物，通過氨基酸的吸收模式直接以螯合物的形式穿過小腸微絨毛被腸黏膜細胞吸收（Found，1974；于昱等，2006）。另外，也有研究證實，Met-Zn并不能完整被吸收，在小腸內(nèi)首先解離后而被轉(zhuǎn)運至體內(nèi)參加代謝。

N-HMM-Ca是通過對DL-Met的氨基進行修飾，雖然沒有氨基，但具備可以轉(zhuǎn)化Met特有的骨架，且因α-NH2被羥甲基化，能避免在瘤胃內(nèi)被脫氨基，具有抗瘤胃微生物降解的功能，從而使Met在瘤胃內(nèi)的降解率下降，過瘤胃后，由于消化道中的pH值降低轉(zhuǎn)化為Met進而被機體吸收利用。

由于體內(nèi)存在著羥基氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶及L-型蛋氨酸氧化酶，可將MHA轉(zhuǎn)化成2-酮基-4-甲硫基丁酸，經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶生成L-Met，從而完成類似物到Met的轉(zhuǎn)化，具有Met的生物活性，達到過瘤胃的保護作用（高紅建，2002）。L-HMB轉(zhuǎn)化為L-Met的效率比D-Met轉(zhuǎn)化為L-Met的效率高，而且，D-HMB能夠在所有組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為L-Met和被用來合成蛋白質(zhì)，其效果與LMet相似（孫華，2012）。

3 過瘤胃蛋氨酸對瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響

3.1 對瘤胃微生物的影響

日糧添加HMB能增加瘤胃總的原蟲數(shù)（Pattern等，1970；Iriki等，1989)。以 30 ml奶牛瘤胃液為底物，體外培養(yǎng)添加HMB 15 mg/d，發(fā)現(xiàn)HMB能增加底物羊草的原蟲數(shù)（P=0.03），可顯著降低青貯玉米原蟲數(shù)（P＜0.05），并且HMB能顯著增加青貯玉米的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量和白色瘤胃球菌數(shù)（P＜0.05），以及苜蓿的黃色瘤胃球菌和反芻獸新月形單胞菌數(shù)（P＜0.05），但對真菌數(shù)沒有影響。但Noftsger等（2005）發(fā)現(xiàn)蛋氨酸類似物鈣鹽(MHA-Ca)對瘤胃液原蟲數(shù)量和細菌氮比例在各組之間差異不顯著。Hegedüs等（1995）以不同蛋氨酸（L-Met、DL-Met、DL-S-甲基蛋氨酸硫氯化物、N-HMM-Ca、MHA和蛋氨酸亞砜）來源作為基質(zhì)培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)觀察瘤胃細菌的生長情況，39℃條件下培養(yǎng)18 h后檢測細菌光學(xué)密度，結(jié)果表明L-和DL-Met能夠促進細菌生長，N-HMM-Ca與DL-S-甲基蛋氨酸硫氯化物能夠顯著降低光密度值（P＜0.05），而以MHA和蛋氨酸亞砜為基質(zhì)作為Met來源對瘤胃內(nèi)細菌生長無影響，這說明N-HMM-Ca與DL-S-甲基蛋氨酸硫氯化物能夠更好的避過瘤胃微生物的降解，具有更好的過瘤胃特性。

3.2 對瘤胃內(nèi)NH3-N、VFA、pH值等影響

研究表明，添加過瘤胃保護性蛋氨酸對降低瘤胃內(nèi)NH3-N濃度有良好的效果。高紅建（2002）通過選擇年齡1歲左右，體重23～25 kg的瘤胃瘺管灘羊羯羊3只，分為3組，分別作為對照組、Met組和N-HMMCa組，試驗發(fā)現(xiàn)瘤胃投放N-HMM-Ca和Met后明顯降低了瘤胃液中NH3-N水平，N-HMM-Ca比Met組降低0.74 mg/ml。段紅偉（2000）在飼喂玉米-草粉型飼糧的甘肅細毛羊羯羊時也同樣發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)投放NHMM-Ca時NH3-N濃度效果優(yōu)于補充Met，并且兩組都顯著少于對照組（P＜0.05）。

一些試驗中添加Met或羥基衍生物、衍生物并不影響瘤胃內(nèi)VFA的濃度和pH值，但有可能改變VFA的組成。高紅建（2002）研究表明綿羊瘤胃中添加NHMM-Ca和Met后，瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）無明顯差異，這與Noftsger等（2003）研究發(fā)現(xiàn)一致。但乙酸和丁酸濃度有增加趨勢（P＜0.1），瘤胃液pH值未受影響，但顯著提高了DM、OM、CP、ADF和NDF在全消化道中的消化率（P＜0.05），而在N-HMMCa和Met組之間無明顯差異(P＞0.05)。熊春梅（2004）在日糧中添加N-HMM-Ca后促進了瘤胃微生物的發(fā)酵和蛋白質(zhì)的合成，與對照組和添加Met組比較降低了瘤胃液中NH3-N濃度（P＜0.05），增加瘤胃乙酸和TVFA的濃度（P＜0.05），對 pH 值和其他VFA無顯著影響（P＞0.05），N-HMM-Ca處理組與對照組比較顯著提高了試驗牛對日糧中DM、ADF和CP的消化率（P＜0.05）。Iriki等(1989)研究發(fā)現(xiàn)，MHA-Ca能影響奶山羊瘤胃發(fā)酵，增加瘤胃內(nèi)容物中乙酸和丙酸的含量，而Met對瘤胃發(fā)酵影響較小。

Spears等（2004）在安格斯肉牛低鋅日糧中以Zn計添加20 mg/kg ZnSO4、甘氨酸鋅(Gly-Zn)和Met-Zn，發(fā)現(xiàn)添加Met-Zn和Gly-Zn組在瘤胃內(nèi)的VFA含量少于對照組和ZnSO4組（P＜0.05），添加Met-Zn提高丙酸摩爾比和降低丁酸和戊酸摩爾比（P＜0.05），可改變瘤胃VFA的比例。Garg等（2008）發(fā)現(xiàn)羔羊日糧中以Zn計添加20 mg/kg ZnSO4和Met-Zn，其DM、CP、可消化CP、乙醚提取物、中性洗滌纖維和半纖維素消化率之間無顯著差異（P＞0.05），但Met-Zn對纖維素和酸性洗滌纖維的消化率有顯著提高（P＜0.05）。

關(guān)于HMB對瘤胃VFA濃度影響的研究不一致，Wilson等（2008）表明HMB不影響瘤胃VFA含量，但有的研究發(fā)現(xiàn)HMB可改變VFA組成（Noftsger等，2003）。

4 過瘤胃蛋氨酸對血液生化指標的影響

過瘤胃保護性氨基酸對血液中游離氨基酸的影響效果不一致，但大部分研究表明血清中蛋氨酸的含量升高。研究表明，羊瘤胃添加N-HMM-Ca組血液總游離氨基酸量高于其它試驗組，但差異不顯著（P＞0.05），瘤胃添加Met組與瘤胃添加N-HMM-Ca組表現(xiàn)相似，其峰值比瘤胃添加N-HMM-Ca組低，但早出現(xiàn)了1.5 h，這可能與Met在瘤胃中快速降解有關(guān)（段紅偉，2000）。熊春梅（2004）同樣發(fā)現(xiàn)，添加N-HMMCa后，試驗牛血漿中尿素氮濃度顯著降低（P＜0.05），白蛋白和總蛋白濃度顯著高于對照組（P＜0.05），游離脂肪酸、葡萄糖、總氨基酸各組間沒有明顯的變化（P＞0.05），Colin-Schoellen等（1995）結(jié)果同樣表明血液中Met濃度不受HMB的影響，但Wang（2010）研究表明添加HMB顯著增加動脈血Met濃度，這一結(jié)果與Spiekers（1990）研究一致，其發(fā)現(xiàn)與添加Met組血清中Met含量（16.8 mmol/l）比較，添加N-HMM-Ca能顯著增加血清中Met含量（22.7 mmol/l），但血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素和尿素氮在各組之間差異不顯著。高紅建（2002）研究同樣表明奶牛日糧中添加N-HMMCa后，血漿中游離Met濃度比對照組顯著升高（P＜0.01），與Met組相比，有顯著升高的趨勢（P＜0.1），并且血漿中含硫AA（Met+Cys）與對照組和Met組相比，也有顯著增高趨勢（P＜0.1）。

5 過瘤胃蛋氨酸對生產(chǎn)性能的影響

過瘤胃保護性蛋氨酸對反芻動物生產(chǎn)性能的影響效果不一，但總體來看，可提高動物的產(chǎn)奶量、產(chǎn)毛量和日增重等，并有效提高了飼料轉(zhuǎn)化效率，對乳成分的影響存在很大分歧，但大多數(shù)研究者認為沒有影響。

研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加N-HMM-Ca(熊春梅，2004；Samuelson等，2001)后顯著提高荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量和乳脂率（P＜0.05），這有可能是因為，添加過瘤胃保護性蛋氨酸優(yōu)化了瘤胃發(fā)酵，促進了瘤胃微生物蛋白的合成，因瘤胃微生物蛋白消化率高達80%，所以使進入小腸消化率高的蛋白質(zhì)增多，有效改善了小腸中氨基酸平衡，促進小腸氨基酸的吸收率。熊春梅（2004）報道添加N-HMM-Ca對奶牛乳蛋白產(chǎn)量和乳蛋白率差異不顯著，但比對照組多產(chǎn)87.94 g/d，乳成分得到明顯的改善。李成會等（2003）研究表明在奶牛日糧中添加0.12%～0.16%MHA-Ca可顯著提高乳蛋白含量（P＜0.05），而Leonardi等（2003）研究表明N-HMMCa對奶牛產(chǎn)奶量和乳成分無顯著影響。另外，孫華(2012)認為添加MHA可以顯著增加奶牛乳脂產(chǎn)量和乳中總固形物的含量(P＜0.05)，有增加乳蛋白量、4%FCM產(chǎn)量和乳脂率的趨勢，但差異不顯著。而Aguilar等(1990)報道，奶牛每頭飼喂Met-Zn 360 mg/d，可提高5%產(chǎn)奶量。麻常勝等（2013）在荷斯坦奶牛種添加Met-Zn 250、500、750 mg/kg，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，產(chǎn)奶量分別提高了1.91、1.75 kg和1.58 kg，均差異顯著（P＜0.05），對乳脂、乳糖、非脂乳固形物含量均無顯著差異（P＞0.05）（麻常勝等，2013；吳志廣等，2008；劉輝放等，2004），但添加Met-Zn能夠有效的延緩奶牛干奶期。

張昭熙等（1996）在育肥黃牛精料中添加不同梯度Met-Zn，顯著提高日增重，500 mg/kg組比對照組提高飼料利用率達10%以上。Puchala等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，添加Met-Zn增加了安哥拉山羊毛產(chǎn)量(P＜0.05)。Spiekers（1990）在產(chǎn)犢前14～100 d泌乳奶牛日糧中添30 g N-HMM-Ca和Met，發(fā)現(xiàn)添加N-HMM-Ca能提高14%的飼料轉(zhuǎn)化率。據(jù)研究，在斷奶后5-12周青年荷斯坦?fàn)倥Ｈ占Z中添加N-HMM-Ca可顯著提高平均增重、肉料比，試驗組比對照組增加0.03%。Spears（1996）對19個試驗進行統(tǒng)計分析，約89.5%的試驗表明，添加Met-Zn能提高飼料轉(zhuǎn)化率，這一結(jié)果也得到Garg等（2008）的支持。

6 過瘤胃蛋氨酸對乳體細胞影響

大量國內(nèi)外試驗一致證明，過瘤胃保護性蛋氨酸能顯著降低反芻動物乳中體細胞數(shù)量。Kellogg（1990）發(fā)現(xiàn)Met-Zn添加20 mg/kg就能使奶牛體細胞下降22%。吳志廣等（2008）試驗發(fā)現(xiàn)，添加Met-Zn分別為100、250、400 mg/kg組與對照組相比，體細胞數(shù)分別降低10.43%、17.88%和19.49%（P＜0.05），而麻常勝等（2013）通過在奶牛日糧中添加Met-Zn為250、500、750 mg/kg，與對照組相比，極顯著降低乳體細胞含量（P＜0.01）。到目前為止，因N-羥甲基蛋氨酸鈣是一種新型過瘤胃蛋氨酸產(chǎn)品，關(guān)于N-羥甲基蛋氨酸鈣對反芻動物乳中體細胞數(shù)量的影響報道的文獻較少。

7 應(yīng)用前景展望

綜上所述，過瘤胃保護性蛋氨酸具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和較高的生物學(xué)效價，通過改變反芻動物瘤胃內(nèi)蛋氨酸降解微生物區(qū)系，避開瘤胃的降解，使達到真胃和小腸的蛋氨酸含量升高，改善消化道后端的氨基酸平衡。提高反芻動物產(chǎn)奶量、產(chǎn)毛量和肉料比，有效的提升乳品質(zhì)和肉品質(zhì)質(zhì)量。并且因其生產(chǎn)工藝簡單、適口性好、生物學(xué)利用率高、價格適中和對環(huán)境造成的負擔(dān)較小，是反芻動物經(jīng)濟有效的蛋氨酸添加劑來源，在實際動物生產(chǎn)和應(yīng)用中有廣闊的應(yīng)用前景。但仍有許多關(guān)鍵因素需要注意和解決，例如過瘤胃蛋氨酸在體內(nèi)的作用機理、轉(zhuǎn)運機制、調(diào)控和代謝途徑仍尚未清晰，缺乏蛋氨酸螯合物或類似物的螯合度的測定標準而無法確保其產(chǎn)品質(zhì)量，過瘤胃蛋氨酸通過何種方式改變瘤胃和腸道內(nèi)環(huán)境而影響動物生產(chǎn)性能的了解不夠深入，過瘤胃保護性蛋氨酸的過瘤胃率檢測并沒有統(tǒng)一的標準或途徑，特別是粉末狀的過瘤胃蛋氨酸，較難檢測。