鄢良春李 波，2華 樺廖 利趙軍寧

（1四川省中醫(yī)藥科學院，成都，610041；2四川省郫縣人民醫(yī)院，郫縣，611730）

液相色譜-質(zhì)譜法同時測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量

鄢良春1李 波1，2華 樺1廖 利1趙軍寧1

（1四川省中醫(yī)藥科學院，成都，610041；2四川省郫縣人民醫(yī)院，郫縣，611730）

目的：建立同時測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）和吳茱萸次堿（Rutaecarpine，RUT）的LC／MS方法。方法：液相色譜采用Welch Materials Xtimate-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3μm），以甲醇-10 mmol／L乙酸銨水溶液（85∶15）為流動相，流速0.2 mL／min，柱溫30℃。質(zhì)譜采用正離子全掃描模式，m／z：0～1000，電噴霧離子化源（ESI）。霧化氣為氮氣，霧化壓力為40 psi；噴霧電壓4000 V，源溫度為100℃；去溶劑氣為氮氣，溫度350℃，流速為10 L／min。結果：吳茱萸堿在2.02～504 ng／mL（r＝0.9992），吳茱萸次堿在1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）線性關系良好，回收率分別為87.8%～97.04%和86.35%～98.22%，日內(nèi)、日間精密度均＜10%。結論：該方法簡便、可靠、靈敏度高，可用于同時測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量及藥代動力學研究。

吳茱萸水提物；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；液相色譜-質(zhì)譜

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth，石虎Evodia rutaecarpa（Juss）Benth var officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth.Var bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，能溫中散寒、疏肝止痛，用于厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉、高血壓、外治口瘡等[1]。近年來，國內(nèi)外學者對吳茱萸的化學成分進行深入研究，主要集中在吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）、吳茱萸次堿（Rutaecarpine，RUT）、檸檬苦素等單體成分的研究[2-4]。吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測定方法一般為HPLC法及液相色譜-紫外檢測法等，多只測定吳茱萸中的單一成分。

中醫(yī)臨床運用中，吳茱萸多以復方水煎為主。前期本研究室對吳茱萸的毒性情況做了比較系統(tǒng)研究，結果表明吳茱萸提取物對大鼠、小鼠均具有一定的毒性作用[5-7]。本研究擬建立一種同時測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的液相色譜-質(zhì)譜法（LC／MS），為進一步研究吳茱萸毒性及其藥代動力學特征奠定基礎[8-9]。

1 實驗材料

1.1 受試藥物 吳茱萸由四川省中醫(yī)藥科學院資源與種植研究所舒光明研究員于重慶紅廟村實地采集并鑒定，由四川省中醫(yī)藥科學院易進海研究員提供水提取物樣品。

1.2 主要試劑 吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品（成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（PAA）；非必需氨基酸（Sigma）。

1.3 主要儀器 美國Agilent 1200 RRLC-6410 triple quadrupole液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配有G1312B二元泵、G1322B真空脫氣機、G1329B自動進樣器和G1316B柱溫箱，使用MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理；超純水系統(tǒng)（Millipore）；CP-225D型精密電子天平（Sartorius），F(xiàn)D-ID-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；XW-80A漩渦混旋儀（上海青浦滬西儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 Welch Materials Xtimate-C18，（2.1 mm×150 mm，3μm）；流動相：甲醇-10 mmol／L乙酸銨水溶液（85：15）；流速：0.2 mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），正離子模式，噴霧電壓4000 V，源溫度為100℃；霧化氣為氮氣，霧化壓力為40 psi；去溶劑氣為氮氣，溫度350℃，流速為10 L／min；碰撞氣為高純氮氣，壓力為0.1 MPa；采用MRM模式對藥物檢測，質(zhì)譜條件如下。

表1 吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿LC／MS法測定條件

2.3 受試樣品吳茱萸水提取物的制備 取吳茱萸藥材，加水煎煮2次，每次加水10倍，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，濾過、濃縮冷凍干燥，即得。每克藥粉含原生藥3.44 g。用DMEM-10培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)液）配成不同濃度溶液，0.22μm過濾器過濾備用。

2.4 樣品預處理 微量加樣器精密吸取待測樣品600 μL置1.5 mL離心管中，加入804 ng／mL卡馬西平40 μL，冷凍干燥后，加入600μL甲醇溶解，渦旋混勻1 min，12 000 r／min離心10 min，0.22μm微孔濾膜過濾，取上清液10μL進樣測定。

2.5 混合對照品溶液的配制 精密稱取吳茱萸堿（EVO）對照品和吳茱萸次堿（RUT）對照品適量，用DMEM-10培養(yǎng)液配制成終濃度分別為504 ng／mL（EVO），493.33 ng／mL（RUT）的對照品混合溶液。作為標準儲備液。4℃冰箱保存。

2.6 方法學考察

2.6.1 方法專屬性 取空白DMEM-10溶液、空白DMEM-10溶液加內(nèi)標卡馬西平、空白DMEM-10溶液加EVO、RUT和內(nèi)標卡馬西平混合物、吳茱萸水提取物DMEM-10溶液，分別經(jīng)LC／MS檢測后，記錄色譜圖，考察其專屬性。

2.6.2 線性關系考察 取空白DMEM-10溶液600 μL，精密加入濃度為804 ng／m L卡馬西平40μL，配成EVO終濃度為2.016、20.16、50.40、100.80、201.60、504 ng／mL，RUT終濃度為1.97、19.73、49.33、98.67、197.33、493.33 ng／mL的混合對照品溶液。按2.4項下方法處理后，進樣10μL經(jīng)LC／MS測定。記錄峰面積。

2.6.3 精密度實驗 在標準曲線范圍內(nèi)取空白DMEM-10溶液，配制EVO、RUT高、中、低3個不同濃度的樣品，按2.4項下方法處理樣品，在1 d內(nèi)分別測定5份樣品，計算日內(nèi)精密度；每天各測定1份樣品，連測5 d，計算日間精密度。

2.6.4 回收率實驗 配制EVO、RUT高、中、低3個濃度樣品，記錄峰面積，計算其回收率。

2.6.5 穩(wěn)定性實驗 在標準曲線范圍內(nèi)用空白DMEM-10溶液配制高、中、低，的EVO、RUT混標溶液，按2.4項下方法操作，分別在冷凍后0，1，2，11和14 d，進行LC／MS含量測定，計算RSD%。

2.6.6 重復性實驗 取受試樣品按2.4項下方法操作，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量，進行重復性實驗。2.7 吳茱萸水提取物樣品吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量測定 按2.3項下制備受試樣品3份，按2.4項下制備成受試樣品溶液，進樣10μL，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量。

3 實驗結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1 方法專屬性 如圖1-圖4所示，在該實驗條件下采用MRM模式對藥物檢測，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和卡馬西平保留時間分別為3.1min、2.3min和4.0 min。結果表明：空白DMEM-10培養(yǎng)液不干擾吳茱萸堿、吳茱萸次堿的測定。（圖1：空白DMEM-10培養(yǎng)液MRM色譜圖，圖2：空白DMEM-10培養(yǎng)液加內(nèi)標卡馬西平MRM色譜圖；圖3：吳茱萸堿、吳茱萸次堿和內(nèi)標卡馬西平混合物MRM色譜圖；圖4：吳茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色譜圖）

圖1 空白DMEM-10培養(yǎng)液MRM色譜圖

圖2 空白DMEM-10培養(yǎng)液加內(nèi)標卡馬西平MRM色譜圖

圖3 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和內(nèi)標卡馬西平混合物MRM色譜圖

圖4 吳茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色譜圖

3.1.2 線性關系考察 以樣品濃度（C）為橫坐標，樣品與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標，進行線性回歸。得到回歸方程：Y吳茱萸堿＝0.0098x+0.0096（r＝0.9992），Y吳茱萸次堿＝0.0073x-0.03（r＝0.9999）。表明吳茱萸堿在2.02～504 ng／mL，吳茱萸次堿在1.97～493.33 ng／m L線性關系良好。

3.1.3 精密度實驗 高、中、低濃度生物樣品日內(nèi)、日間峰面積與內(nèi)標物峰面積之比RSD＜10%，精密度良好，結果見表2。

表2 精密度實驗結果

3.1.4 回收率實驗 高、中、低濃度生物樣品回收率大于85%，滿足生物樣品分析檢測的要求，結果見表3。

表3 回收率實驗結果（n＝6）

3.1.5 穩(wěn)定性試驗 生物樣品中各成分在-20℃冰箱保存14 d，測定混合對照品和內(nèi)標物的峰面積。各濃度樣品測定值的RSD均小于7.0%，說明在低溫條件下，14 d內(nèi)各成分的穩(wěn)定性良好，結果見表4。

表4 穩(wěn)定性實驗結果

3.1.6 重復性實驗 重復性考察結果顯示，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的RSD均小于5%，符合實驗要求。

3.2 受試樣品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量測定結果顯示，800μg／mL的吳茱萸水提物中吳茱萸堿（EVO）的含量為（36.86±0.30）μg／mL、吳茱萸次堿（RUT）為（41.08±0.29）μg／m L。結果見表5。

表5 含量測定結果

4 討論

吳茱萸是常用溫理藥，本草記載吳茱萸生品有小毒，但其臨床應用廣泛，含有多種活性成分，具有多種藥理作用，尤以在心血管系統(tǒng)方面作用的研究進展迅猛。關于吳茱萸中主要活性成分如吳茱萸堿、吳茱萸次堿等的研究已經(jīng)深入到分子和基因水平。中藥成分復雜、含量微少，一般的分離儀器與測定方法難以對中藥成分進行分離和檢測。

本研究建立同時測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的LC／MS法，操作簡便，靈敏度高，重復性好，樣品專屬性、分離度、精密度、回收率等均符合生物樣品檢測的相關要求。且檢測樣品用量少，樣品預處理方法簡便，與液液萃取、固相萃取和直接蛋白沉淀等樣品處理方法相比，該方法具有待測成分損失較小，不受雜質(zhì)干擾等優(yōu)點，特別適合大批量樣品分析測定及吳茱萸體內(nèi)、體外藥代動力學研究。LC／MS法與液相色譜法、紫外檢測法等分析方法相比，具有更高的靈敏度。本實驗研究結果提示，LC／MS法將在中藥材及中成藥制劑化學成分的定量分析中具有廣闊的應用前景。

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[2]欒連軍，裘國麗，程翼宇.吳茱萸堿和吳茱萸次堿在家兔體內(nèi)的藥動學研究[J].中國藥學雜志，2006，41（1）：48-50.

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（2014-01-06收稿 責任編輯：洪志強）

Simultaneous Determination of Evodiamine and Rutaecarpine in Water extracts of Evodia rutaecarpa by LC-MS

Yan Liangchun1，Li Bo1，2，Hua hua1，Liao Li1，Zhao Junning1
（1 Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2 Pixian People＇s Hospital，Pixian 611730，China）

Objective：To establish a LC-MS method for the simultaneous determination of evodiamine and tutaecarpine in water extracts of Evodia rutaecarpaMethods：A Welch Materials Xtimate-C18（2.1mm×150mm，3μm）was used.The mobile phase consisting of a mixture of methanol and 10 mmol／L ammonium acetate（85：15）was delivered at a flow-rate of0.2 mL／min.The column temperature was maintained at 30℃.The mass spectrometer was operated under the positive ion mode.Atomization pressure（N2）was40 psi，voltage was 4000v and temperature was100℃.The drying gas（N2）flow was10 L／min，the drying gas temperature was 350℃.Results：The linear ranges were 2.02～504 ng／mL（r＝0.9992）and 1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）for evodiamine and rutaecarpine.The method extraction recoveries of evodiamine and rutaecarpine were 87.8%～97.04%and 86.35%～98.22%respectively.The intra and inter-day RSD were also lower than 10%.Conclusion：The method is simple，reliable and sensitive.It can be used for the pharmacokinetics research of water extracts of Evodia rutaecarpa.

Water extracts of Evodia rutaecarpa；Evodiamine；Rutaecarpine；LC-MS

R284.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.004

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（編號：2011ZX09401-304-（4-1））；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（編號：2009CB522801）；國家自然科學基金面上項目（編號：81073047）

鄢良春，碩士，副研究員，E-mail：yanlc9722＠163.com

趙軍寧，男，研究員，博士生導師，電話：（028）85226120，E-mail：zarmy＠189.cn