■郝 鐲 李 楠 王雅麗 蔡玉峰 李樹民 劉 全 王承宇 李吉平

（1.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春 130122；2.吉林農業(yè)大學，吉林長春 130118）

飼料添加劑是維持畜禽健康、促進生長、提高家畜肉質品質的重要影響因素，抗生素曾一度作為必需的飼料加劑長期應用于各類飼料中，但是濫用抗生素引起的藥物殘留及產生的細菌耐藥嚴重危害人類健康[1]。隨著人們食品安全意識的加強，迫切要求有一種廣譜、安全、高效、無毒的“綠色添加劑”代替抗生素?？咕膹V泛存在于自然界中，具有廣譜的抗菌作用，以及抗病毒、真菌和原蟲的作用，且不易產生耐藥性[2]，可以代替抗生素添加于飼料中。兩棲動物皮膚抗菌肽以其廣譜、高效的特性成為研究的熱點。本研究以野生東北黑斑蛙為材料，通過對其皮膚分泌物分離、純化，以期獲得抑菌活性較強的抗菌肽，為新型、綠色飼料添加劑的研制與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與菌種

野生東北黑斑蛙（Rana nigromaculata）100只，其中幼年組50只，體重(5±0.5)g，成年組50只，體重（20.0±0.5）g，采樣于吉林省白山市靖宇縣。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus,MRSA）、金黃色葡萄球菌（S.aureus ATC29213）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸桿菌（E.coliATC25922）均購于中國國家菌種冷藏中心。

1.1.2 試劑

三氟乙酸（TFA,Sigma)、乙腈（ACN,Merck)均為色譜純試劑，α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA，ICN），顯色劑（TTC，上海威方）。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀（LC-8A，定量環(huán) 100 μl，SHIMADZU）、C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，ACE）、高速低溫離心機（Eppendorf）、MALDI-TOF/TOF質譜儀（BRUKER）、酶標儀（Thermo）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo）、生化培養(yǎng)箱（上海智誠）、96孔細胞培養(yǎng)板（Costar）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽粗品的制備

采用電刺激法[3]，10 V電壓間斷刺激蛙背部皮膚5～10 min，蛙背部出現(xiàn)無色透明分泌物，用超純水反復清洗背部皮膚，并收集在一起，低溫濃縮，12 000 r/min離心10 min，用10 kD超濾膜超濾，收集濾液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗菌肽活性檢測

將大腸桿菌 ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC25923培養(yǎng)到對數(shù)生長期，稀釋為0.5個麥氏濃度標準的菌液涂MH培養(yǎng)板，取待檢液200 μl制作藥敏片，貼附于培養(yǎng)板表面，37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。觀察抑菌圈情況。

1.2.3 抗菌肽粗品的初步分離

用高效液相色譜儀對抗菌肽粗品進行初步分離，色譜條件：C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為215 nm；流動相：以超純水+0.05%TFA為流動相A，以60%ACN+0.05%TFA為流動相B，上樣量為75 μl，以1 ml/min流速進行梯度洗脫，洗脫條件為在0-5-25-80-90 min時間段內，流動相B的濃度依次為0%-0%-10%-70%-100%。見峰收集，經濃縮后進行活性檢測以確定活性峰。1.2.4 抗菌肽的第二次分離純化

將上述有較好抑菌作用的洗脫峰進行第二次分離純化。成年組洗脫梯度如下：0-5-10-50-55 min范圍內其流動相B的濃度為0%-0%-10%-70%-100%。幼年組洗脫梯度如下：0-5-10-50-55 min范圍內其流動相B的濃度為0%-0%-10%-40%-100%，其余同1.2.3。

1.2.5 抗菌肽的質譜鑒定

取1 μl有活性的抗菌肽組分峰樣品，點靶，待樣品晾干后，取1 μl HCCA基質點靶。然后將靶放入質譜儀，用FlexControl軟件進行數(shù)據(jù)采集；用FlexAnalysis軟件進行數(shù)據(jù)分析，測出分子量。

1.2.6 最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）的測定

將顯色劑TTC用培養(yǎng)基配制成5 g/l，100 μl/孔鋪入96孔細胞培養(yǎng)板中。試驗采用微量二倍稀釋法，用新配制的TSB培養(yǎng)基調整抗菌肽濃度，使其濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/ml，每個濃度設置3個重復。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及MRSA在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適宜濃度，利用麥氏比濁儀調整濃度至0.5個麥氏單位，100 μl/孔鋪入培養(yǎng)板中，此時抗菌肽的濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。同時設置陰性對照組（只加培養(yǎng)基）及陽性對照組（只加菌液）。將96孔培養(yǎng)板放入37℃生化培養(yǎng)箱，16 h后觀察結果。結果判定：如有細菌生長，TTC會變?yōu)榧t色，將沒有細菌生長的最低濃度作為該抗菌肽的MIC值。

2 結果

2.1 抗菌肽粗品的抑菌檢測

以大腸桿菌及金黃色葡萄球菌為測試菌，通過藥敏片法對抗菌肽粗品的抑菌效果進行檢測，成年組與幼年組皮膚抗菌肽粗品均具有抑菌作用，成年組抑菌圈直徑分別為22、25 mm，幼年組抑菌圈直徑分別為14、18 mm。

2.2 抗菌肽的分離、純化（見圖1、圖2）

經HPLC分析，成年組黑斑蛙皮膚抗菌肽粗提物共得到89個洗脫峰，其中62號洗脫峰（AMP1）抑菌效果較好；幼年組共得到34個洗脫峰，23號洗脫峰(AMP2)抑菌效果較好。

2.3 質譜鑒定（見圖3、圖4）

經質譜鑒定，AMP1及AMP2純度較高，分子量分別為3 349.205 Da及1 373.820 Da。

2.4 最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration MIC）結果（見表1）

圖1 成年組高效液相色譜圖

圖2 幼年組高效液相色譜圖

圖3 AMP1質譜鑒定圖譜

由表1可知，對AMP1及AMP2最小抑菌濃度的測定結果表明，AMP1及AMP2對G+及G-均有抑菌作用。

3 討論

目前，將抗菌肽作為飼料添加劑而獲得較好飼喂效果的例子很多，如王曉楠等[4]將天蠶素抗菌肽添加入肉雞的飼料中，提高了肉雞的生產性能和抗病能力。柴仙琦等[5]通過將不同濃度的抗菌肽添加于凡納濱對蝦飼料中，分別得到了提高對蝦成活率、增重率，降低了飼料系數(shù)等效果?？咕膹V泛存在于動物、植物中，從兩棲類皮膚分泌物中能夠分離出有較強抗菌活性的抗菌肽，所以提取兩棲類皮膚抗菌肽是獲得天然抗菌肽的一個重要途徑。

圖4 AMP2質譜鑒定圖譜

表1 AMP1、AMP2最小抑菌濃度檢測結果(μg/ml)

本試驗應用反相高效液相色譜分離東北地區(qū)廣泛存在的野生黑斑蛙的皮膚抗菌肽，試驗發(fā)現(xiàn)，在相同的洗脫條件下，幼年組與成年組的分離組分相差較大，即成年組組分較多，而幼年組組分較少，由此可以推斷兩棲類不同生長階段分泌抗菌活性成分不同。通過最小抑菌濃度（MIC）試驗發(fā)現(xiàn)，分離到的兩種抗菌肽對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有較強的抑菌效果，尤其是從成年組黑斑蛙皮膚上分離得到的AMP1，對MRSA具有較強的抑制作用。由于生物來源的天然抗菌肽獲取數(shù)量有限，不能滿足現(xiàn)實需要，所以在后續(xù)的試驗中，我們將對分離得到的AMP1及AMP2進行測序工作，然后進行固相合成，保證動物試驗的順利進行。針對目前細菌抗藥性增強的難題，抗菌肽的廣譜抗菌作用且不易產生耐藥性的特點，使其可以作為傳統(tǒng)抗生素的替代品，成為一種新型、綠色飼料添加劑。

4 結論

①野生黑斑蛙皮膚活性成分成年組明顯多于幼年組。

②幼年組及成年組野生黑斑蛙皮膚抗菌肽對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均具有抑菌作用，成年組抑菌作用強于幼年組。

③抗菌肽以其抗菌譜廣及不易產生耐藥性的特點，使其可以代替抗生素，成為新型飼料添加劑。