劉 波，曾麗萍，鄔應龍,*

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉 波1，曾麗萍2，鄔應龍1,*

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

研究碳源、氮源、無機鹽對紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的酶活性影響。在單因素試驗的基礎上，采用響應面試驗設計對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并建立乳糖、(NH4)2SO4、K2HPO4變化的二次回歸方程，探討各因素對生淀粉酶酶活力的影響。在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，最終確定適宜的培養(yǎng)基條件為：乳糖添加量為8.18%、(NH4)2SO4添加量為6.36%、K2HPO4添加量為0.91%；在該條件下可得到紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的最大酶活力，預測值為680.29 U/g，對實驗結果進行驗證，得到生淀粉酶酶活力為662.21 U/g。

紅曲霉；固態(tài)發(fā)酵；生淀粉酶；Box-Behnken試驗設計

生淀粉酶是指能對不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現(xiàn)出強水解活性的酶類。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接轉化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25%～30%的能耗[1-2]?；跍p少能耗和有效利用天然資源的需要，生淀粉的生物能轉化過程引起了廣大科研人員的關注，并對能降解生淀粉的酶類進行了研究[3-9]。大量研究[10-14]表明，許多真菌和細菌都能夠產(chǎn)生生淀粉酶，并且通過發(fā)酵條件等方法的優(yōu)化，其產(chǎn)酶能力可大大增強。如蔡宇杰等[15]用遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡相耦聯(lián)的方法對生淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，使生淀粉的活力得到較大的提高。劉軍等[16]則采用了黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉和少根根霉，并進行混株發(fā)酵，從而使分解生淀粉能力得到顯著提高。與此同時，研究人員對生淀粉酶的研究主要集中在液態(tài)發(fā)酵[9,12,17]而對固態(tài)發(fā)酵的研究較少。本研究在對生淀粉產(chǎn)生菌的最佳碳源、氮源和無機鹽的種類和數(shù)量需要進行系統(tǒng)研究的基礎上，應用響應面法（response surface methodology，RSM）[18-22]對其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行篩選和優(yōu)化，旨在提高該菌株的產(chǎn)酶量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲霉M2 四川農(nóng)業(yè)大學功能性實驗室保藏。

麩皮 雅安市雨城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場購買；NaNO3、MgSO4、K2HPO4、葡萄糖、乳糖等均為國產(chǎn)分析純；PDA培養(yǎng)基（斜面）：土豆300.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂20.0 g/L；種子培養(yǎng)基：土豆300.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L；固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：麩皮10.0 g、蒸餾水12.0 mL。

1.2 儀器與設備

BT-124S型電子天平 北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 重慶四達實驗儀器有限公司順達儀器廠；HHS-9S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器設備有限公司；JOUANBR4i型冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-2102型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

取培養(yǎng)好的斜面，用無菌生理鹽水洗脫孢子后轉移至裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，充分搖動使孢子散開，用帶脫脂棉的無菌漏斗過濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調(diào)整到106個/mL。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將1 mL孢子懸液接種到固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，在32 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)6 d測定其酶活力。

1.3.3 粗酶液的制備

粗酶液的制備：取培養(yǎng)后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，先稱質(zhì)量，然后加蒸餾水100 mL，在40 ℃水浴中浸提1 h，4層紗布過濾，3 000 r/min離心15 min。

1.3.4 指標測定

生淀粉酶活力的測定：參考孫海彥等[12]的方法。先取2.0 mL 2.5 g/100 mL的生玉米淀粉懸浮液，然后加入2.0 mL 0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0），40 ℃預熱10 min，然后再加入1.0 mL粗酶液。40 ℃水浴反應30 min后，加入0.5 mL 4 g/100 mL NaOH溶液終止反應，反應液用3 000 r/min離心10 min，取上清液用DNS法[23]測葡萄糖量。空白實驗為先加0.5 mL 4 g/100 mL NaOH溶液，再加入酶液，用以消除酶液和生玉米淀粉中游離糖的影響。

生淀粉酶活力單位的定義：在該測定條件下，1 h釋放1 μmol葡萄糖的酶量定義為一個酶活力單位。

1.3.5 培養(yǎng)基成分的篩選

1.3.5.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加質(zhì)量分數(shù)1%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和乳糖，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的碳源種類。

1.3.5.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加1%的蛋白胨、牛肉膏、尿素、NaNO3和(NH4)2SO4，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活性的大小確定最佳的氮源種類。

1.3.5.3 無機鹽對產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加0.1%的K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和CaCl2，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活性的大小確定最佳的無機鹽種類。

1.3.6 培養(yǎng)基各成分添加量的單因素試驗

1.3.6.1 碳源添加量對產(chǎn)酶的影響

根據(jù)碳源的篩選結果，選擇酶活性最高的作為最適碳源。在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的碳源添加量。

1.3.6.2 氮源添加量對產(chǎn)酶的影響

根據(jù)氮源的篩選結果，選擇酶活性最高的作為最適氮源。在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的氮源添加量。

1.3.6.3 無機鹽添加量對產(chǎn)酶的影響

根據(jù)無機鹽的篩選結果，選擇酶活性最高的作為最適無機鹽。在固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，分別添加0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的無機鹽添加量。

1.3.7 響應面試驗優(yōu)化設計

根據(jù)單因素的試驗結果，選用乳糖、(NH4)2SO4、K2HPO4為考察因素，采用Box-Behnken中心組合原理設計三因素三水平的響應曲面法試驗。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 碳源的篩選

碳源作為真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，能夠為真菌的生長代謝提供能量。同時它也是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發(fā)育必需的能源物質(zhì)。某些碳源是酶的誘導物，選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成。不同碳源對生淀粉酶酶活的影響如圖1所示，紅曲霉可以利用不同的碳源，但碳源類型對生淀粉酶酶活性的高低影響較小。其中以乳糖為碳源時，生淀粉酶酶活性要高于其他幾種碳源。因此，選用乳糖作為紅曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源對生淀粉酶酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.1.2 氮源的篩選

氮的主要功能是提供細胞原生質(zhì)和其他結構物質(zhì)中的氮素，是微生物細胞需要量僅次于碳的元素。它是真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，用于合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮類代謝物。不同氮源對生淀粉酶酶活性的影響如圖2所示。紅曲霉能很好的利用有機氮源蛋白胨和無機氮源(NH4)2SO4。兩種有機氮源中，蛋白胨的效果明顯好于牛肉膏。在3種無機氮源中，以(NH4)2SO4的效果最好。由于考慮到成本問題，故選擇以(NH4)2SO4作為紅曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 氮源對生淀粉酶酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.1.3 無機鹽的篩選

除了上述的碳源和氮源外，微生物通常還需要一定量的無機鹽來調(diào)節(jié)其生長代謝，比如磷是核酸和蛋白質(zhì)的重要組成成分，能夠影響微生物的生長；而鎂作為許多重要酶的激活劑則能夠影響基質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)合成。不同無機鹽對生淀粉酶酶活性的影響如圖3所示，添加K2HPO4的生淀粉酶酶活性最高，說明K2HPO4對紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶優(yōu)于其他幾種無機鹽。因此，選擇在固體培養(yǎng)基中添加K2HPO4。

圖3 無機鹽對生淀粉酶酶活性的影響Fig.3 Effect of mineral salt on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.2 培養(yǎng)基各成分添加量的單因素試驗結果

2.2.1 乳糖添加量對生淀粉酶酶活性的影響

根據(jù)碳源的篩選結果，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵選用乳糖作為最佳碳源。由圖4可知，隨著乳糖添加量的增加，生淀粉酶酶活性逐漸升高；當乳糖的添加量達到8%時，酶活性達到最大；而當乳糖添加量繼續(xù)增加時，生淀粉酶酶活性反而下降，這表明過大的添加量并不利于酶活性的增大。故在本實驗的考察范圍內(nèi)乳糖的最佳添加量為8%。

圖4 乳糖的不同添加量對生淀粉酶酶活性的影響Fig.4 Effect of lactose level in the medium on the activity of rawstarch-digesting amylase

2.2.2 (NH4)2SO4添加量對生淀粉酶酶活性的影響

圖5 (NH4)2SO4不同添加量對生淀粉酶酶活性的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate level in the medium on the activity of raw-starch-digesting amylase

由圖5可知，(NH4)2SO4添加量在1%～6%的范圍內(nèi)，生淀粉酶酶活性隨著添加量的增加而增大，但當(NH4)2SO4的添加量超過6%時，生淀粉酶酶活性隨著(NH4)2SO4的增加而減小。這表明過多的添加量并不利于酶活性的升高，只有適宜的添加范圍內(nèi)才有利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。故在本實驗的考察范圍內(nèi)(NH4)2SO4的添加量選擇6%。

2.2.3 K2HPO4添加量對生淀粉酶酶活性的影響

圖6 K 6 K2HPOHPO4的不同添加量對生淀粉酶酶活性的影響Fig.6 Effect of dipotassium hydrogen phosphate level in the medium on the activity of raw-starch-digesting amylase

由圖6可知，K2HPO4添加量在0.1%～0.8%范圍內(nèi)，生淀粉酶的酶活性隨著添加量的增加而增大，但當K2HPO4添加量超過1.0%時，生淀粉酶酶活性隨著K2HPO4添加量的增加而減小。這表明過大的添加量并不利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。只有適宜的添加量條件下才有利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。故在本實驗考察范圍內(nèi)K2HPO4的最佳添加量為0.8%。

2.3 響應面試驗設計優(yōu)化結果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

表1 響應面分析試驗結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design Expert v7.0.0（Stat-Ease，Inc. minneapolis, MN，USA）軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)表1的試驗結果，對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生生淀粉酶酶活力（Y）對乳糖（X1）、(NH4)2SO4（X2）、K2HPO4（X3）的多項回歸方程為：

對試驗結果進行方差分析，結果如表2所示。

表2 生淀粉酶酶活性多項式回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model for raw-starch-digesting amylase

由表2可知，建立的回歸模型顯著（P＜0.05），說明方程擬合度較好；失擬項P=0.150 3＞0.05，說明失擬項不顯著，殘差由隨機誤差引起，模型選擇正確；復相關系數(shù)R2=0.994 5，表明預測值和實測值之間具有很高的相關性；調(diào)整性決定系數(shù)，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述實驗結果。

2.3.2 響應面優(yōu)化及分析

圖7 乳糖和(NH4)2SOSO4添加量對生淀粉酶酶活性影響的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of lactose and ammonium sulphate on the activity of raw-starch-digesting amylase

圖8 乳糖和K2HPO4添加量對生淀粉酶酶活性影響的響應面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of lactose and dipotassium hydrogen phosphate on the activity of raw-starch-digesting amylase

圖9 ((NH4)2SO4和KK2HPO4添加量對生淀粉酶酶活性影響的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of ammonium sulphate and dipotassium hydrogen phosphate on the activity of rawstarch-digesting amylase

由圖7～9可知，它們分別反應了X1、X2、X3這3個因素的兩兩交互作用對響應值的影響。通過Design Expert軟件，進行分析計算，可得到紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的最佳培養(yǎng)基配方為：乳糖添加量為8.14%、(NH4)2SO4添加量為6.41%、K2HPO4添加量為0.91%，在此條件下生淀粉酶酶活力預測值可達680.29 U/g。結合實際操作的方便和方差分析結果，最終確定培養(yǎng)基配方為：乳糖為8.18%、(NH4)2SO4為6.36%、K2HPO4為0.91%。即在22.0 g固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，乳糖添加量為1.80 g、(NH4)2SO4添加量為1.40 g、K2HPO4添加量為0.2 g。

2.3.3 模型的驗證

為了驗證紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的精確性，對該模型進行驗證實驗。按照此最終培養(yǎng)基參數(shù)進行3次重復實驗，可得生淀粉酶酶活力平均值為662.21 U/g，實驗值與預測值（680.29 U/g）相差較小。表明此模型是可行有效的，并具有一定的實踐參考價值。

3 結論與討論

通過培養(yǎng)基的篩選，確定了紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的最佳培養(yǎng)基配方：碳源為乳糖，氮源為(NH4)2SO4，無機鹽為K2HPO4。在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，對紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過響應面法對試驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化與評價，得到影響生淀粉酶酶活力的二次多項式回歸模型，并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：乳糖添加量為8.18%、(NH4)2SO4添加量為6.36%、K2HPO4添加量為0.91%；在此條件下可得到生淀粉酶的最高酶活，預測值為680.29 U/g，對實驗結果進行驗證，可得生淀粉酶酶活力平均值為662.21 U/g，與理論預測值基本一致證明該模型合理可靠。研究人員通過采用不同方法來提高菌種產(chǎn)生淀粉酶的活力。如羅軍俠[24]以Aspergillus fumigalus MS-09為研究對象，對其產(chǎn)耐酸生淀粉糖化酶的培養(yǎng)基條件進行了篩選。在優(yōu)化條件下，其酶活力可達27.59 U/mL。朱文優(yōu)等[2]以米曲霉y18為出發(fā)菌株，通過2次誘變，獲得了產(chǎn)生淀粉酶活力較高的菌株y18-U-36-D-40，其酶活力達到434.5 U/mL。孫海彥等[12]通過搖瓶發(fā)酵，研究了培養(yǎng)基成分對Penicillium sp.X-1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的影響，在最優(yōu)條件下酶活力達到239 U/mL。劉連成等[25]通過正交試驗優(yōu)化得出菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，結果表明以玉米淀粉為碳源，蛋白胨和酵母膏為復合氮源時生淀粉酶活力可達194.9 U/mL，是優(yōu)化前的1.1倍。蘇小軍等[14]以黑曲霉 AF-1為研究對象，對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，得出培養(yǎng)基豆粕粉含量、麩皮添加量和溫度的最佳值分別為11.46%、17.41 g和26.26 ℃，優(yōu)化后的酶活力為204 U/mL。就上述所測得的酶活力相差較大除了菌種不同的原因外，更多可能是測定方法及酶活力定義不統(tǒng)一所致。目前紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的研究未見詳細報道。本研究中固態(tài)發(fā)酵具有成本低廉、工藝簡單、零污染等優(yōu)點，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

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Optimization of Medium Components for the Production of Raw-Starch-Digesting Amylase by Monascus M2 in Solid State Fermentation

LIU Bo1, ZENG Li-ping2, WU Ying-long1,*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The activity of raw-starch-digesting amylase produced by Monascus M2 in solid state fermentation was investigated with respect to three medium components including carbon source, nitrogen source and inorganic salt. Response surface methodology was used to optimize three different levels of lactose, (NH4)2SO4and K2HPO4by setting up a quadratic regression model. The optimized basic solid medium contained 8.18% lactose, 6.36% (NH4)2SO4and 0.91% K2HPO4. The resulting maximum predicted activity of raw-starch-digesting amylase was 680.29 U/g, compared to 662.21 U/g observed in validation experiments.

Monascus; solid-state fermentation; raw-starch-digesting amylase; Box-Behnken experiment design

TS231

A

1002-6630（2014）07-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201407036

2013-07-10

劉波（1987—），男，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：scmslb0425@163.com

*通信作者：鄔應龍（1963—），男，教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：wuyinglong99@163.com