郝 冉，王正明，查學(xué)強(qiáng)，潘利華，羅建平

霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性及在小腸中的吸收分布

郝 冉，王正明，查學(xué)強(qiáng)，潘利華，羅建平*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，中草藥與功能食品研究所，安徽 合肥 230009）

目的：研究霍山石斛多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）的小鼠腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性以及在小腸內(nèi)的吸收分布。方法：通過溴化氰活化法對DHP進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測熒光標(biāo)記前后的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性；通過口服和離體小腸培養(yǎng)以及Peyer’s結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)，用激光共聚焦顯微鏡檢測DHP在小腸內(nèi)的吸收分布以及與Peyer’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果：DHP在質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL和200 μg/mL時，其腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性分別提高到對照組的112.8%、131.1%、137.6%和160.5%，熒光標(biāo)記不改變DHP腸黏膜免疫活性；DHP在體內(nèi)和體外均可被小腸吸收，分 布于腸黏膜固有層內(nèi)，并可與Peyer’s結(jié)內(nèi)細(xì)胞結(jié)合。結(jié)論：DHP具有腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，可以通過Peyer’s結(jié)細(xì)胞被小腸吸收，并分布于固有層內(nèi)。

霍山石斛；多糖；熒光標(biāo)記；腸黏膜；分 布

腸黏膜免疫系統(tǒng)是體內(nèi)最大和最復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，由組織化的淋巴組織和分散的淋巴細(xì)胞組 成，其中Peyer’s結(jié)是一種重要的腸黏膜組織化淋巴組織，是腸黏膜免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)位點[1]。研究表明，中藥及其多糖口服后能夠通過小腸吸收[2-3]，調(diào)節(jié)腸黏膜免疫，進(jìn)而通過細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞歸巢影響系統(tǒng)免疫[4-6]。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng）是一種名貴藥食同源植物，具有保肝、明目、益 胃的功能[7]，多糖是其主要活性成分[8]。 藥理學(xué)研究表明，霍山石斛多糖具有抗氧化[9-10]、抗白內(nèi)障[11-12]、抗糖基化[13]、抗肝損傷和肝纖維化[14]、抗疲勞[15]和免疫調(diào)節(jié)[16-18]等活性，但關(guān)于霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性和口服后在小腸內(nèi)的吸收分布還不清楚。本實驗采用溴化氰活化法對霍山石斛均一多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測其腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，并在體內(nèi)和體外分析DHP在小腸內(nèi)的吸收分布及與小腸細(xì)胞的結(jié)合，以期闡明霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性及在小腸中的吸收分布，為霍山石斛多糖功能性食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛均一多糖DHP按本實驗室Zha Xueqiang等[17]的方法制備，分子質(zhì)量為6 400 u。SPF級雄性昆明小鼠（6～8 周，（20±2）g）購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

Sephadex G25 美國Sigma公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Thermo Fisher公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；Alamar Blue試劑盒 上海貝博試劑公司；熒光素胺 美國Aldrich公司；冰凍切片包埋劑O.C.T 美國Sakura公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；MCO-17AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；CM1900冷凍切片機(jī) 德國Leica公司；TCS SP5激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光標(biāo)記DHP的制備

用溴化氰活化法對DHP進(jìn)行熒光標(biāo)記[19]。將1 mL DHP溶液（20 mg/mL）與0.2 mL溴化氰（cyanogens bromide，CNBr）溶液（50 mg/mL）混合，邊振蕩邊加入0.25 mol/L NaOH維持pH 11以上15 min。反應(yīng)混合液利用Sephadex G25（1.0 cm ×15 cm）以pH 8.0的0.2 mol/L硼酸鈉緩沖液洗脫，流速1.5 mL/min。收集含多糖的組分，立即加入2 mg熒光素胺室溫下避光反應(yīng)18 h。反應(yīng)所得亮黃色溶液利用Sephadex G25（1.0 cm×15 cm）將熒光標(biāo)記的多糖與游離的熒光素胺分離，洗脫液為不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），pH 8.0，流速1.5 mL/min。用分部收集器收集，每管2 mL，測定每管中糖含量和熒光素胺含量?；厥胀瑫r含多糖和熒光素胺的組分，即為熒光標(biāo)記的多糖fl-DHP。多糖含量用苯酚-硫酸法測定[20]，熒光素胺含量按文獻(xiàn)[19]方法測定。

1.3.2 腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性

多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性測定按照Hong等[4]的方法。小鼠處死后，70%酒精浸泡消毒。無菌取小腸，用Hank’s平衡鹽溶液清洗干凈，小心從小腸壁上分離Peyer’s結(jié)，置于冷的含有體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。用注射器活塞通過4 層紗布磨碎Peyer’s結(jié)，離心取細(xì)胞，用含有5%胎牛血清的Hank’s平衡鹽溶液洗滌 2次，每次1 500 r/min離心10 min。將細(xì)胞重懸于1 mL完全培養(yǎng)基中，用臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL。將Peyer’s結(jié)細(xì)胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，每孔加入不同質(zhì)量濃度的DHP或fl-DHP 20 μL（終質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100、200 μg/mL），每組5 個平行。置5% CO2、37 ℃增濕環(huán)境下培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，離心取Peyer’s結(jié)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。骨髓細(xì)胞懸液按照文獻(xiàn)[4]制備。將骨髓細(xì)胞懸液加入96 孔板中，每孔100 μL，另加50 μL的完全培養(yǎng)基以及50 μL Peyer’s結(jié)細(xì)胞條件培養(yǎng)基，置5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束前5 h，每孔加入20 μL的Alamar Blue試劑，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束，利用Varioskan Flash酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為544 nm、發(fā)射波長為590 nm波長處測定熒光強(qiáng)度。多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性用相對于空白對照組（僅加PBS）的骨髓細(xì)胞增殖表示。

為了檢測DHP與fl-DHP對骨髓細(xì)胞增殖是否具有直接促進(jìn)作用，用終質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP直接培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，用Alamar Blue試劑檢測細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 DHP在體內(nèi)的小腸吸收

取雄性昆明小鼠9 只，隨機(jī)分為3 組。在灌胃處理前，小鼠禁食12 h，自由飲水?？瞻讓φ战M每只小鼠灌胃0.5 mL PBS，熒光素胺對照組每只小鼠灌胃0.5 mL 5 μg/mL熒光素胺溶液，fl-DHP處理組每只小鼠灌胃0.5 mL 100 μg/mL fl-DHP溶液。分別在灌胃0、0.5 h和3 h后處死小鼠，取出回腸段，用PBS小心的沖洗干凈后，液氮冷凍。將小腸修剪成合適大小后，加適量的O.C.T制作冰凍切片，利用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

1.3.4 DHP在體外的小腸吸收

取雄性昆明小鼠9 只，隨機(jī)分為3 組，禁食12 h，自由飲水。小鼠處死后，取出回腸段，小心用PBS沖洗干凈。仔細(xì)的將腸腔翻轉(zhuǎn)，使黏膜層暴露在外部，將腸段一端用絲線扎緊，向腸腔內(nèi)注入適量的PBS后扎緊另一端。將處理好的回腸段分別置于含PBS或5 μg/mL熒光素胺或100 μg/mL fl-DHP的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)0、0.5 h和3 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出腸段，用PBS清洗干凈后液氮冷凍。制作冰凍切片，用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

1.3.5 DHP體外與Peyer’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合

按照1.3.2節(jié)的方法制備Peyer’s結(jié)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL。將1 mL P eyer’s結(jié)細(xì)胞懸液加入24 孔板中，加PBS或5 μg/mL熒光素胺或100 μg/mL fl-DHP后37 ℃培養(yǎng)1 h。離心取細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍之后，用200 μL PBS重懸。將細(xì)胞懸液滴在載玻片上，晾干后置于4%甲醛溶液中固定1 h以上，用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

為檢測DHP對fl-DHP與Peyer’s結(jié)細(xì)胞結(jié)合的抑制作用，先用含有100 μg/mL DHP的培養(yǎng)基37 ℃條件下培養(yǎng)Peyer’s結(jié)細(xì)胞1 h，離心取細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍之后，再用含有100 μg/mL fl-DHP的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，制作細(xì)胞涂片，用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 fl-DHP的制備與分離

經(jīng)溴化氰活化后的DHP與熒光素胺反應(yīng)，所得混合溶液用Sephadex G25分離，測定洗脫組分中總糖和熒光素胺含量并繪制洗脫曲線。如圖1所示，同時含有多糖和熒光素胺的組分即為fl-DHP。

圖1 CNBr-活化的DHP與熒光素胺反應(yīng)產(chǎn)物洗脫曲線Fig.1 Elution profile of the reaction products of CNBr-activated DHP with fluoresceinamine

2.2 DHP與fl-DHP的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性分析

圖2 DHP與fl-DHP腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性Fig.2 Intestinal mucosal immunomodulating activities of DHP and fl-DHP

盡管不同終質(zhì)量濃度0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP對骨髓細(xì)胞的增殖沒有直接的促進(jìn)作用，但DHP和fl-DHP均能通過Peyer’s結(jié)細(xì)胞顯著促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖，并且具有劑量依賴效應(yīng)（圖2）。當(dāng)DHP在質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL時，骨髓細(xì)胞增殖分別提高到112.8%、131.1%、137.6%和160.5%。fl-DHP與DHP的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性沒有顯著差異，表明熒光標(biāo)記不影響DHP的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性。

2.3 DHP在體內(nèi)的小腸吸收

圖3 DHP在體內(nèi)的小腸吸收（×630）Fig.3 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

如圖3所示，PBS對照組中各時間段均未在小腸內(nèi)檢測到熒光，用熒光素胺灌胃0.5 h和3 h后能夠在腸道內(nèi)檢測到熒光，表明熒光素胺可以通過小腸吸收。用fl-DHP對小鼠灌胃處理0.5 h后，即可在腸道固有層觀察到熒光，在灌胃3 h后，能檢測到較強(qiáng)的熒光。由于fl-DHP中不含游離的熒光素胺，且溴化氰活化法標(biāo)記的多糖已被證明在生理條件下可以保持穩(wěn)定[21]，因此結(jié)果表明DHP可以經(jīng)小腸吸收，并分布于腸道固有層。

2.4 DHP在體外的小腸吸收

圖4 DHP在體外的小腸吸收（×630）Fig.4 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

由圖4可知，PBS體外培養(yǎng)的小鼠小腸不同時間段均未檢測到熒光，用熒光素胺體外培養(yǎng)小鼠小腸，在0.5 h和3 h后能夠檢測到熒光存在，表明熒光素胺可以通過離體小腸吸收。在對離體小腸用fl-DHP處理0.5 h后，即可在腸道固有層檢測到熒光，處理3 h后，能檢測到較強(qiáng)的熒光，結(jié)果與體內(nèi)實驗一致。

2.5 DHP體外與Peyer’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合

圖5 DHP在體外與Peyyeerr’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合（×630）Fig.5 Binding of DHP to Peyer’s patch cells in vitro (×630)

圖6 熒光標(biāo)記細(xì)胞占觀察的Peyyeerr’s 結(jié)細(xì)胞的比例Fig.6 Ratio of fluorescent labeled cells in Peyer’s patch cells

圖5、6顯示DHP與Peyer’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合情況。用PBS處 理的Peyer’s結(jié)細(xì)胞未檢測到熒光，而熒光素胺處理Peyer’s結(jié)細(xì)胞可以檢測到少量的熒光，表明熒光素胺可以與Peyer’s結(jié)內(nèi)某些細(xì)胞結(jié)合。用fl-DHP處理Peyer’s結(jié)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大量Peyer’s結(jié)細(xì)胞可以與fl-DHP結(jié)合。利用DHP預(yù)先處理Peyer’s結(jié)細(xì)胞后再與fl-DHP結(jié)合，結(jié)果顯示結(jié)合細(xì)胞的數(shù)量有所下降，表明DHP可以競爭性抑制fl-DHP與Peyer’s結(jié)細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)一步證明DHP可以與Peyer’s結(jié)某些細(xì)胞結(jié)合。

3 結(jié) 論

本實驗對霍山石斛均一多糖DHP腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性以及在小腸中的吸收分布進(jìn)行了初步的研究。結(jié)果表明DHP可以通過Peyer’s結(jié)刺激骨髓細(xì)胞的增殖；溴化氰活化法對DHP進(jìn)行熒光標(biāo)記不改變DHP的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性。體內(nèi)和體外實驗表明，DHP可以與Peyer’s結(jié)內(nèi)的某些細(xì)胞結(jié)合，通過小腸吸收，并分布于腸道固有層。但是DHP的吸收機(jī)制以及DHP與Peyer’s結(jié)細(xì)胞結(jié)合的種類與方式還需要進(jìn)一步研究。

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Intestinal Mucosal Immunomodulating Activity of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Absorption and Distribution in Small Intestine

HAO Ran, WANG Zheng-ming, ZHA Xue-qiang, PAN Li-hua, LUO Jian-ping*
(Institute of Traditional Chinese Medicine and Functional Foods, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefe i 230009, China)

Objective: To investigate the intestinal mucosal immunomodulating activity of a homogeneous Dendrobiu m huoshanense polysaccharide (DHP) and its absorption and distribution in the small intestine of mice. Methods: DHP was labeled with fuoresceinamine via cyanogen bromide activation, and the intestinal mucosal immunomodulating activity was detected. A confocal laser scanning microscope was used to detect the absorption of DHP and binding to P eyer’s patch cells via oral administration, in vitro small intestine co-culture and co-culture with Peyer’s patch cells. Results: Th e intestinal mucosal immunomodulating activity was increased by 12.8%, 31.1%, 37.6% and 60.5% when compared with the control at DHP conce ntrations of 25, 50, 100 and 200 μg/mL, respectively. Fluorescent labeli ng had no effect on t he intestinal mucosal immunomodulating activity of DHP. It could not only be absorbed through the small intestine in vivo and in vi tro, but also could distribute in intestinal lamina propria and bind to certain cells in Peyer’s patches. Conclusion: DHP possesses intestinal mucosal immunomodulating activity and can be absorb ed through Peyer’s patch cells of the small intestine.

Dendrobium huoshanense; pol ysaccharides; fluorescent labeling; intestinal mucosa; distribution

Q94

A

1002-6630（2014）09-0256-04

10.7506/spkx1002-6630-201409050

2013-06-19

安徽省科技攻關(guān)計劃項目（12010402088）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21006019）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31271814）

郝冉（1988—），女，碩士，研究方向為中草藥與功能食品。E-mail：haoran43253@163.com

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與分子營養(yǎng)。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn