邢 佳，陶明煊,*，郭宇星，程光宇，趙云霞，蔣文亭，張夢宇，杜偉佳

雞樅菌精多糖對酒精性損傷小鼠腎及免疫器官的抗氧化作用

邢 佳1，陶明煊1,*，郭宇星1，程光宇2，趙云霞1，蔣文亭1，張夢宇1，杜偉佳1

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

目的：研究雞樅菌精多糖（refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus，RTAP）對酒精所致急性肝損傷小鼠腎、脾臟及胸腺的保護作用。方法：采用超聲波輔助的熱水浸提法提取雞樅菌多糖，小鼠被隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（飼喂聯(lián)苯雙酯，150 mg/（kg·d））、RTAP各劑量組（100、200、400 mg/（kg·d）），連續(xù)灌胃30 d，正常組按等量生理鹽水灌胃。第31天除了正常組外，給予50%乙醇（12 mL/kg）建立動物急性肝損傷模型。小鼠處死后取腎臟、脾臟、胸腺，測定各項抗氧化指標(biāo)。結(jié)果：與模型組相比，RTAP各劑量組均能降低腎臟、脾臟及胸腺丙二醛含量，提高各器官超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性及谷胱甘肽含量。結(jié)論：RTAP對酒精性損傷小鼠腎及免疫器官具有明顯的抗氧化作用，其原理應(yīng)該與其所具有抗脂質(zhì)過氧化和清除體內(nèi)過多的氧自由基作用有關(guān)。

雞樅菌多糖；抗氧化；酒精性損傷；腎；免疫器官

過量飲酒會導(dǎo)致許多臟器損害，如肝臟、腎臟、脾臟等，乙醇經(jīng)CYP2E1系統(tǒng)可生成大量的活性氧基團（reactive oxygen species，ROs），引發(fā)脂質(zhì)過氧化（lipid peroxide，LPO）[1]。肝臟是酒精代謝的主要器官，也是最容易受損的器官。而腎臟是乙醇重要的排泄器官，人體攝入5%～10%的酒精是通過腎臟氧化與排泄的，酒精等水溶性外源物質(zhì)在腎臟細胞和間質(zhì)內(nèi)積聚、濃縮，對腎臟會造成一定程度的損害[2]。此外還有研究表明，飲酒過量對哺乳動物脾臟和胸腺的生長發(fā)育具有顯著的抑制作用，引起脾臟細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，細胞膜通透性增強，膜表面受體受損，進而影響機體的免疫功能[3-4]。

雞樅菌，是珍貴的食用菌，又名蟻樅、雞腳麟菇，屬擔(dān)子菌綱，傘菌科。它不但味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且還能延緩衰老，提高機體抗病毒能力，有報道稱這可能是由于其中含有大量多糖物質(zhì)的原因[5]，而多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂和增強機體免疫力的作用[6]。本實驗以雞樅菌為原材料，探討雞樅菌精多糖（refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus，RTAP）對酒精性損傷小鼠腎及免疫器官的保護作用，旨在為保健食品或天然藥物的研制和開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞樅菌（Termitomyces albuminosus）子實體干品購自云南麗江市古城區(qū)喜瑪拉雅貿(mào)易有限責(zé)任公司，經(jīng)去雜質(zhì)，剪去含培養(yǎng)基的根部，于60 ℃低溫烘干后粉碎加工成60 目細粉。將細粉經(jīng)超聲波輔助水提、濃縮、4 倍體積乙醇沉淀、低溫干燥等步驟后，得到粗多糖，粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、低溫干燥后得到RTAP，經(jīng)測定多糖含量為68.15%，蛋白質(zhì)含量為1.33%。

1.2 動物

揚州種雄性6 周齡小鼠，體質(zhì)量（19.01±0.817） g，動物試驗在江蘇省中醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心進行，動物飼養(yǎng)許可證號（SYXK（蘇）2012-0047）。

1.3 試劑與儀器

四乙氧基丙烷 Fluka公司；NBT、DTNB 南京卓爾生化有限公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、谷胱甘肽（L-glutathione，GSH） 美國Sigma公司；無水乙醇、H2O2、硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid，TBA）等生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

JY92-Ⅱ超聲波細胞破碎器 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷凍離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；722可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酒精誘導(dǎo)肝損傷動物模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（飼喂聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg·d））、RTAP各劑量組（100、200、400 mg/（kg·d）），每組11 只。受試樣品用蒸餾水配制，每天灌胃受試樣品1 次，連續(xù)灌胃30 d，實驗期間供給全價顆粒飼料，不限制飲食飲水。實驗至第31天，各組小鼠禁食不禁水12 h后，陽性對照組、RTAP各劑量組及模型組以12 mL/kg（以體質(zhì)量計）的量，用50%乙醇溶液灌胃，建立小鼠急性肝損傷模型，正常組灌予等體積的蒸餾水。去除死亡小鼠，每組10 只，均在灌胃12 h后，脫臼處死小鼠，取腎臟、脾臟及胸腺測定各抗氧化損傷指標(biāo)。

1.4.2 腎臟、脾臟及胸腺勻漿的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g腎臟，用生理鹽水洗去污血后拭干，剪碎并加入0.9 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），于冰水浴中進行超聲破碎（400 W，20 s×3）制成10%腎勻漿。腎勻漿于4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，一部分上清液用于測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，另一部分上清液以3∶1的比例加飽和硫酸銨溶液，同樣條件下離心上清液即為粗酶液，用于測定超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。脾臟及胸腺勻漿以同樣的方法制備。

1.4.3 指標(biāo)測定

過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物MDA含量：采用TBA法[7]測定；GSH含量：按文獻[8]方法測定；GSH-Px活性：采用DTNB法測定[9]；SOD活性：按Stewert等[10]的NBT光化還原法測定；CAT活性：采用紫外分光光度法[11]測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用DPS13.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，單因素方差分析，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RTAP對酒精損傷后小鼠腎及免疫器官中的MDA含量影響

表1 RTAP對小鼠腎及免疫器官MDA含量影響（x±s，n=10）Table 1 Effect of RTAP on MDA contents in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表1可知，經(jīng)造模后，小鼠各器官模型組MDA水平均明顯高于正常組，呈顯著性差異（P＜0.05）。給予RTAP后，多糖各劑量組MDA水平均有顯著性降低，呈一定的量效關(guān)系。多糖高劑量組腎的MDA含量不僅與正常組含量相當(dāng)甚至好于藥物組。說明RTAP能有效改善小鼠腎損傷及免疫器官中的脂質(zhì)過氧化水平。

2.2 RTAP對酒精損傷后小鼠腎及免疫器官中的GSH含量影響

表2 RTAP對小鼠腎及免疫器官GSH含量影響（x±s，n=10）Table 2 Effect of RTAP on GSH contents in kidney and immune organs of mice（x± s,, n=10）

由表2可見，經(jīng)造模后，腎、脾臟和胸腺中GSH的含量均低于正常組，表明酒精會造成腎、脾臟及胸腺中GSH含量的降低，給予RTAP后，各劑量組的GSH含量都明顯比模型組高。其中高劑量組脾GSH含量已與正常組水平相當(dāng)；高劑量組胸腺GSH含量已超過陽性對照組；高劑量組腎GSH含量未達到陽性對照組水平，但隨著多糖劑量的增加，可明顯提高腎勻漿中的GSH含量。說明RTAP能顯著提高小鼠腎及免疫器官中GSH含量，增強機體的抗氧化能力，減輕酒精對小鼠腎及免疫器官的損害作用。

2.3 RTAP對酒精損傷后小鼠腎及免疫器官中的GSH-Px活性影響

表3 RTAP對小鼠腎及免疫器官GSH-Px活性影響（x±s，n=10）Table 3 Effect of RTAP on GSH-Px activities in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表3可見，經(jīng)造模后，腎、脾臟和胸腺中GSH-Px的活性均低于正常組，呈顯著性差異（P＜0.05）。給予RTAP后，各劑量組GSH-Px活性均比模型組高，其中高劑量組脾臟GSH-Px含量甚至比模型組提高了346.48%；高劑量組胸腺GSH-Px活性已超過陽性對照組，且具有顯著性（P＜0.05）；高劑量組腎GSH-Px活性雖未達到陽性對照組水平，但隨著多糖劑量的增加，可明顯提高腎勻漿中的GSH-Px活性。從各臟器中GSH-Px活性的變化可以看出，RTAP對酒精性損傷小鼠腎與免疫器官有一定抗氧化作用。2.4 RTAP對酒精損傷后小鼠腎及免疫器官中的SOD活性影響

表4 RTAP對小鼠腎及免疫器官SOD活性影響（x±s，n=10）Table 4 Effect of RTAP on SOD activities in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表4可見，經(jīng)造模后，腎、脾臟和胸腺中SOD活性均低于正常組，呈顯著性差異（P＜0.05）。給予RTAP后，各劑量組SOD活性均比模型組高，且隨著多糖劑量組的增加SOD活性也提高，呈一定的量效關(guān)系。其中高劑量組腎、脾臟中SOD活性已超過陽性對照組；高劑量組胸腺SOD活性雖未達到陽性對照組水平，但隨著多糖劑量的增加，可明顯提高胸腺勻漿中的SOD活性。說明RTAP能提高腎及免疫器官內(nèi)SOD活性，減少了酒精對其損傷。

2.5 RTAP對酒精損傷后小鼠腎及免疫器官中的CAT活性影響

表5 RTAP對小鼠腎及免疫器官CAT活性影響（x±s，n=10）Table 5 Effect of RTAP on CAT activities in kidney and immune organs of mice（x±s，n=10）

由表5可知，經(jīng)造模后小鼠腎、脾臟和胸腺CAT活性顯著低于正常組（P＜0.05）。給予RTAP后，多糖各劑量組CAT活性均呈量效關(guān)系增加，高劑量組腎、脾臟和胸腺CAT活性與模型組相比分別提高了58.86%、128.28%、103.78%，其中胸腺的CAT活性甚至超過了陽性對照組水平。說明RTAP可改善因飲酒而導(dǎo)致的臟器細胞的衰老程度。

3 討 論

臨床實驗已經(jīng)證實：飲酒過量會導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷、發(fā)生炎癥反應(yīng)等，產(chǎn)生的細胞因子將作用于腎間質(zhì)，促進細胞外基質(zhì)的積聚[2]，引起間質(zhì)纖維化[12-13]，使小鼠腎臟內(nèi)促氧化物質(zhì)增多和抗氧化物質(zhì)減少，促生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎細胞壞死或凋亡。此外，在免疫方面，酒精還可降低胸腺和脾臟[14]或其兩者的淋巴細胞生成量和釋放率及淋巴細胞亞群的相對含量，降低免疫力。

MDA、GSH、GSH-Px、SOD、CAT水平是衡量臟器抗氧化程度的重要指標(biāo)[15-19]。本實驗以雞樅菌為原材料，通過建立急性酒精肝損傷模型，探討了RTAP對氧化損傷小鼠的抗氧化作用主要是提高組織的抗氧化酶和降低MDA含量來實現(xiàn)的。結(jié)果表明，造模后小鼠腎臟、脾臟及胸腺GSH含量減少，SOD、GSH-Px和CAT活性下降，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量增加，與正常組對比，均達到了顯著性差異，與急性酒精性損傷機理研究結(jié)果相符。而喂飼各劑量RTAP的小鼠腎臟和免疫器官的GSH-Px、SOD、CAT活性均得到了較明顯的改善，GSH含量逐漸增加，MDA含量也明顯降低，這可能是通過RTAP預(yù)處理提高內(nèi)源性抗氧化防御體系實現(xiàn)的。說明RTAP對受損小鼠臟器組織有較好的抗氧化作用。

細胞氧化損傷的途徑有很多，不同的途徑都會加速機體的衰老，因此從天然的食品中尋找高效安全的自由基清除劑，已迫在眉睫。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)[20-23]，許多食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的活性，起到保護生物膜，延緩衰老和提高機體免疫的作用，而雞樅菌多糖不僅具有抗氧化作用，還對T細胞免疫功能具有明顯的增強作用[6,24]，這也與本結(jié)果相符。從食用菌中提取天然抗氧化物質(zhì)是當(dāng)前保健食品開發(fā)研究的發(fā)展方向之一，隨著研究的不斷深入，RTAP在生物抗氧化方面將有更廣闊應(yīng)用前景。

[1] 劉玉紅. 酒精性肝病的研究進展[J]. 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報, 2010, 32(4): 301-304.

[2] CAO Yanxue, WANG Bingyuan, FU Baoyu. Alcoholic hepatic and renal lesion and expression of laminin, collagen Ⅲ in kidney[J]. World Chinese Journal of Digestology, 2001, 9(10): 1134-1138.

[3] 楊鄭州. 長期飲酒對小鼠性腺及免疫器官的影響[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009: 59-67.

[4] 韓邦榮, 張符光. 我國胸腺研究現(xiàn)狀與展望[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進展, 1997, 25(1): 83-86.

[5] 王思蘆, 汪開毓, 彭艷伶, 等. 野生雞縱菌多糖的提取及其免疫活性分析[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(12): 1276-1286.

[6] 王思蘆, 汪開毓, 趙玲, 等. 雞樅菌多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(1): 59-63.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)[S].

[8] JAYAKUMAR T, SAKTHIVEL M, THOMAS P A, et al. Pleurotus ostreatus, an oyster mushroom, decreases the oxidative stress induced by carbon tetrachloride in rat kidneys, heart and brain[J]. Chemico-Biological Interactons, 2008, 176(2/3): 108-120.

[9] YAO Ping, LI Ke, JIN You, et al. Oxidative damage after chronic ethanol intake in rat tissues: prophylaxis of Ginkgo biloba extract[J]. Food Chemistry, 2006, 99: 305-314.

[10] STEWERT R C, BEWLEY J D. Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes[J]. Plant Physiology, 1980, 65(2): 245-248.

[11] CHIANG M C, CHOU CC. Expression of superoxide dismutase, catalase and thermostable direct hemolysin by, and growth in the presence of various nitrogen and carbon sources of heat-shocked and ethanol-shocked Vibrio parahaemolyticus[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(3): 268-274.

[12] 張軍. 腎臟纖維化的研究進展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 生理、病理科學(xué)與臨床分冊, 2002, 22(6): 593-595.

[13] 許珊珊, 趙建榮, 孫德珍, 等. ERK信號通路與腎臟疾病關(guān)系的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2013, 7(2): 806-808.

[14] 吳文俊. 老鼠模式之急性酒精暴露抑制脾臟自然殺手細胞功能的機制研究[C]//南京: 海峽兩岸首屆毒理學(xué)研討會論文摘要集, 2001: 20.

[15] MISHRA A, PAUL S, SWARNAKAR S. Downregulation of matrix metalloproteinase-9 by melatonin during prevention of alcohol induced liver injury in mice[J]. Biochimie, 2011, 93(5): 854-866.

[16] DAI Tiane, WU Yong, LENG Aishe, et al. RXRα-regulated liver SAMe and GSH levels influence susceptibility to alcoholinduced hepatotoxicity[J]. Experimental and Molecular Pathology, 2003, 75(3): 194-200.

[17] GORROCHETY R, CASARIL M, BELLSOLA G, et al. Severe impairrment of antioxidennt system in human hepatoma[J]. Cancer, 1986, 58: 1658.

[18] 朱秀敏. 超氧化物歧化酶的生理活性[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2011, 17(15): 26-27.

[19] 劉靈芝, 鐘廣榮, 熊蓮, 等. 過氧化氫酶的研究與應(yīng)用新進展[J]. 化學(xué)與生物工程, 2009, 26(3): 15-18.

[20] 金城. 食用菌多糖的抗氧化活性[J]. 微生物學(xué)通報, 2013, 40(4): 720.

[21] 李波, 徐貴華, 蘆菲, 等. 七種云南產(chǎn)食用菌的抗氧化活性研究[J].食用菌與健康, 2010(2): 66-67.

[22] 李芳亮, 趙立冬, 高楊, 等. 兩種食用菌多糖提取物的抗氧化活性比較研究[J]. 湖南農(nóng)大學(xué)學(xué)報, 2011(9): 108-111.

[23] 孫娟, 鄭朝輝, 劉磊, 等. 4種珍稀食用菌粗多糖的抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 38(3): 404-409.

[24] 王思蘆, 汪開毓, 耿毅, 等. 雞樅菌多糖對小鼠T細胞免疫功能的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2013, 43(1): 77-83.

Antioxidant Effect of Polysaccharide from Termitomyces albuminosus on Kidney and Immune Organs in Mice with Alcoholic Hepatic Injury

XING Jia1, TAO Ming-xuan1,*, GUO Yu-xing1, CHENG Guang-yu2, ZHAO Yun-xia1, JIANG Wen-ting1, ZHANG Meng-yu1, DU Wei-jia1
(1. College of Ginling, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)

Objective: The protective effect of a refined polysaccharide fraction from Termitomyces albuminosus (RTAP) on kidney, spleen and thymus in mice with acute alcoholic hepatic injury was investigated. Methods: The refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus was extracted by ultrasound-assisted hot water. Mice were randomly divided into blank control group, alcoholic injury model group, positive control group (administered with 150 mg/(kg·d) bifendate by gavage) and RTAP groups at doses of 100, 200 and 400 mg/(kg·d). All mice were administered for 30 days prior to administration of 50% alcohol 12 mL/(kg·d) except that the blank control group was given an identical volume of saline. After alcohol treatment, all mice were sacrificed through cervical dislocation and subjected to analysis of antioxidant capabilities in the kidney, spleen and thymus. Results: Compared with the model control group, the contents of MDA in kidney, spleen and thymus were obviously decreased, while the contents of GSH and activities of SOD, CAT and GSH-Px were obviously increased in the RTAP treatment groups. Conclusion: RTAP has antioxidant effect on kidney and immune organs in mice with alcoholic hepatic injury, and the mechanisms might be associated with its antioxidant activity.

Termitomyces albuminosus polysaccharide; antioxidant; alcohol injury; kidney; immune organs

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0246-04

10.7506/spkx1002-6630-201409048

2013-06-14

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101314）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2011787）；江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目（13KJB550013）

邢佳（1989—），女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)與保健功能因子。E-mail：Christina_320@yeah.net

*通信作者：陶明煊（1970—），男，副教授，碩士，研究方向為生物活性物質(zhì)與保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn