魏 杰，宋 威，石 佳

金褐霉素高產(chǎn)相關(guān)基因的篩選與表達(dá)

魏 杰，宋 威，石 佳

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

通過(guò)高效表達(dá)金褐霉素生物合成基因簇中的調(diào)控基因來(lái)提高其產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)從野生金褐鏈霉菌SYAU0709克隆aurJ3M基因，連接載體pMD19-T并測(cè)序。將帶有aurJ3M基因的表達(dá)質(zhì)粒pBJAUM轉(zhuǎn)化金褐鏈霉菌SYAU0709，高效表達(dá)aurJ3M基因，獲得重組菌株。通過(guò)高效液相色譜分析檢測(cè)，重組菌株的金褐霉素產(chǎn)量提高約6倍，并且遺傳性能穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)果說(shuō)明過(guò)量表達(dá)aurJ3M基因能夠提高金褐霉素的產(chǎn)量。

金褐鏈霉菌；金褐霉素；aurJ3M基因；發(fā)酵

金褐霉素（Aureofuscin）是從我國(guó)土壤中分離得到的鏈霉菌新種——金褐鏈霉菌（Streptomyces aureofuscus n.sp）所產(chǎn)生的一種四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的納他霉素（Natamycin）結(jié)構(gòu)相似。1975年金褐霉素被發(fā)現(xiàn)，上海藥物研究所金褐霉素研究小組對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學(xué)特性和急性毒性做了初步研究，但一直未作深入研究和進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)[1-2]。2006—2007年，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)王華等[3]先后報(bào)道了金褐鏈霉菌固體種子培養(yǎng)的相關(guān)研究；金褐鏈霉菌發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化[4]；以及金褐霉素高產(chǎn)菌株的推理選育研究[5]。本課題組從2008年開(kāi)始先后報(bào)道了金褐霉素分離提取工藝的條件優(yōu)化[6]；選育獲得金褐霉素高產(chǎn)菌株[7]，并研究前體物質(zhì)來(lái)提高其發(fā)酵產(chǎn)量[8]；以及aurj3M基因的獲得和序列分析等[9]。然而，有關(guān)金褐霉素合成的分子機(jī)制以及從基因工程的角度構(gòu)建工程菌提高金褐霉素產(chǎn)量的研究鮮有報(bào)道，本研究為開(kāi)發(fā)除納他霉素以外的以及具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型生物防腐劑提供了先機(jī)。

本課題組是在前期獲得了金褐霉素生物合成基因簇的基因aurj3M以及建立了一套金褐霉素的快速檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究aurJ3M及重要調(diào)控基因的功能和表達(dá)結(jié)果，通過(guò)高效表達(dá)關(guān)鍵基因，優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移等方法，構(gòu)建基因工程菌來(lái)提高金褐霉素的發(fā)酵產(chǎn)量，這對(duì)促進(jìn)我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的食品防腐劑和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展都具有積極意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種

金褐鏈霉菌SYAU0709（Streptomyces aureofuscus n.sp）、納塔爾鏈霉菌JCM4693（Streptomyces natalensis） 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌JM109（基因克隆受體菌）、大腸桿菌ET12567 日本TaKaRa公司。

1.2 試劑

凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒 沈陽(yáng)寶信生物科技有限公司。

所有分子生物學(xué)工具酶：BamHI、XbaI、EcoRV、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶，PMD19-T Vector、氯霉素（25 μg/mL）、四環(huán)素（10 μg/mL） 日本TaKaRa公司；安普霉素（50 μg/mL）、氨芐青霉素（100 μg/mL）美國(guó)Sigma公司；其余生化藥品為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

穿梭質(zhì)粒pSET152（DH5a）、質(zhì)粒pGH113、質(zhì)粒pKC1139、質(zhì)粒pJL117和部分抗生素 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)宋淵教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒構(gòu)建等具體方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[10-12]。

1.3 質(zhì)粒pBJAUM的構(gòu)建

質(zhì)粒pGH113用Xba I和BamH I酶切得到ErmEp片段，質(zhì)粒pSET152也用Xba I和BamH I雙酶切，把純化好的ErmEp片段和pSET152連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBJERM。將前期工作中得到的aurj3M基因的兩端加上BamH I和EcoR V酶切位點(diǎn)（根據(jù)基因島中DNA的限制性酶切位點(diǎn)及酶切圖譜分析得出），設(shè)計(jì)引物，并在引入的酶切位點(diǎn)下加下劃線。上游引物（Primer Bm4）：5’-GTGGATCCTCACTTCACGAAGTCGTC CA-3’；下游引物（Primer Em5）：5’-GTGATATCATG GCGAGCCTTGATAGAAC-3’），與經(jīng)過(guò)BamH I和EcoR V酶切的載體pBJERM連接，獲得aurj3M基因的高效表達(dá)質(zhì)粒pBJAUM。

1.4 大腸桿菌與金褐鏈霉菌的屬間接合轉(zhuǎn)移[13]

帶有pBJAUM的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ET12567（pUZ8002），得到轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化子的過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在LB中，在合適抗生素下，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，到合適濃度OD600nm值為0.4～0.6收集菌體；用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次，0.1 倍體積的LB懸浮備用。

將適量的孢子加入2 倍YT培養(yǎng)基，50 ℃處理10 min，離心，去大部分上清。冰上冷卻后與備用大腸桿菌混勻；按1∶1與備用中的大腸桿菌混勻；30 ℃培養(yǎng)13～20 h左右用適當(dāng)濃度的抗生素和萘啶酮酸覆蓋；30 ℃培養(yǎng)數(shù)天（一般2 d）可得到接合轉(zhuǎn)移子；挑選接合轉(zhuǎn)移子到含適當(dāng)抗生素和萘啶酮酸的平板上，并驗(yàn)證。

1.5 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[7]

將種子液接種到裝液量為50 mL的250 mL三角瓶中，接種量10%，搖床發(fā)酵溫度29 ℃，220 r/min，發(fā)酵72 h。

1.6 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中金褐霉素含量

樣品處理：取發(fā)酵液1 mL，加入9 mL甲醇，充分振蕩后，于10 000 r/min高速離心10 min，所得上清液即為HPLC待測(cè)液。

HPLC法：流動(dòng)相為甲醇-水（60∶40，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)303 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，等度洗脫，定性定量檢測(cè)金褐霉素[6]。

圖1 質(zhì)粒pBJAUM的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pBJAUM

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pBJAUM的構(gòu)建與驗(yàn)證

圖2 質(zhì)粒pBJAUM的驗(yàn)證Fig.2 Electrophoresis analysis of plasmid pBJAUM

圖1顯示在質(zhì)粒pBJAUM中，約740 bp DNA片段包含前期工作獲得的aurj3M基因（579 bp）和啟動(dòng)子ermE*P片段，均克隆到具有多克隆位點(diǎn)的載體pSET152上。質(zhì)粒pBJAUM的PCR驗(yàn)證見(jiàn)圖2A，編號(hào)為J2、J3、J4質(zhì)粒在約600 bp處有明顯條帶，說(shuō)明aurj3M基因順利插入質(zhì)粒中；而編號(hào)J1質(zhì)粒在約600 bp處沒(méi)有條帶，說(shuō)明aurj3M基因沒(méi)有插入質(zhì)粒中。編號(hào)J2、J3、J4的質(zhì)粒pBJAUM進(jìn)行BamHI＋EcoRV雙酶切驗(yàn)證，由圖2B可知，切下約579 bp的片段和5.8 kb的載體片段，其中579 bp的片段與插入目的片段大小相符，說(shuō)明目的基因已成功插入到穿梭質(zhì)粒pSET152的多克隆位點(diǎn)中。

2.2 質(zhì)粒pBJAUM在金褐鏈霉菌傳代中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

在含安普霉素和萘啶酮酸的平板上篩選接合轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化子，獲得20 個(gè)轉(zhuǎn)化子，分別挑取并在YSA平板上培養(yǎng)恢復(fù)產(chǎn)孢，提取質(zhì)粒；與帶有質(zhì)粒pBJAUM的大腸桿菌ET12567（pUZ8002）轉(zhuǎn)化子做酶切證明比較。由圖3可知，雙酶切證明金褐鏈霉菌傳代后的轉(zhuǎn)化子與提自大腸桿菌中的完全相同，BamH I＋EcoR V雙酶切切下579 bp的片段和5.8 kb的載體片段。說(shuō)明質(zhì)粒pBJAUM在金褐鏈霉菌中可穩(wěn)定自我復(fù)制，沒(méi)有發(fā)生進(jìn)一步的重組。

圖3 質(zhì)粒pBJAUM的酶切鑒定Fig.3 Analysis of plasmid pBJAUM from the recombinant strain by double-restriction-enzyme digestion

2.3 質(zhì)粒pBJAUM在金褐鏈霉菌SYAU0709中的表達(dá)

在前期培養(yǎng)和發(fā)酵條件優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，將野生菌株和接合轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化子同時(shí)分別培養(yǎng)，并搖瓶發(fā)酵。HPLC分析測(cè)定發(fā)酵液中金褐霉素含量。帶有高效表達(dá)質(zhì)粒pBJAUM（含有增強(qiáng)目的基因aurJ3M）的轉(zhuǎn)化子，金褐霉素的合成能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵產(chǎn)量明顯高于野生菌株，最高者提高了6 倍，如圖4所示。野生菌株SYAU0709為0號(hào)，1～16 號(hào)是實(shí)驗(yàn)挑選的轉(zhuǎn)化子，從金褐霉素的發(fā)酵產(chǎn)量結(jié)果比較來(lái)看，說(shuō)明基因aurJ3M的增強(qiáng)表達(dá)能夠促進(jìn)金褐霉素的生物合成，它起到正調(diào)控作用。

圖4 SYAU0709和轉(zhuǎn)化子的金褐霉素發(fā)酵結(jié)果Fig.4 The yields of aureofuscin in S. aureofuscus SYAU0709 and the recombinant strains

實(shí)驗(yàn)將野生菌株SYAU0709和重組菌株同時(shí)分別劃線培養(yǎng)，在相同的條件下，野生菌株要經(jīng)過(guò)8 d才能看到產(chǎn)出黃色的金褐霉素，然而重組菌株生長(zhǎng)2 d就能明顯看到產(chǎn)出金褐霉素。從圖5的SYAU0709和重組菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)金褐霉素的對(duì)比圖，能明顯看出重組菌株生產(chǎn)金褐霉素的能力更強(qiáng)，菌株均在YSA培養(yǎng)基中29 ℃條件下培養(yǎng)3 d，從黃色產(chǎn)物生成上能看出重組菌（左側(cè)）搖瓶中產(chǎn)量高，速度更快，同時(shí)也說(shuō)明了在重組菌株中的表達(dá)質(zhì)粒起到促進(jìn)金褐霉素合成的作用。

圖5 SYAU0709菌株和重組菌株的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth status of the wild-type strain SYAU0709 and the recombinant strains

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金褐霉素及其產(chǎn)生菌——金褐鏈霉菌的報(bào)道很少，國(guó)內(nèi)對(duì)金褐霉素高產(chǎn)基因及分子生物學(xué)上的相關(guān)研究還很少，因此，研究金褐霉素產(chǎn)生菌中的不同調(diào)控基因及生物合成基因簇的功能研究等對(duì)了解金褐霉素的生物合成以及促進(jìn)工業(yè)化的生產(chǎn)有重要實(shí)踐意義。

本課題組從Streptomyces aureofuscus中獲得了金褐霉素生物合成基因標(biāo)志aurJ3M，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出來(lái)的功能作用與納他霉素調(diào)控基因pimM的作用非常相似，而且對(duì)兩者的基因序列進(jìn)行分析[9]，發(fā)現(xiàn)兩者具有95%的相似性，這兩種蛋白的氨基酸序列同源性為97%。推測(cè)金褐霉素生物合成基因簇也與納他霉素相似，由類似的可讀框架組成，其中包括類似的聚酮合成酶，因?yàn)榻鸷置顾睾图{他霉素都是含有四烯大環(huán)內(nèi)酯，其骨架環(huán)的形成由聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）催化完成的，所以PKS應(yīng)該具有較高的相似性，由類似的酮酰基載體蛋白合成酶、?；D(zhuǎn)移酶（Ata）、酮基還原酶、脫水酶、烯酰還原酶、?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）和硫酯酶（thioesterase，TE）模塊組成[14-20]，有與pimM類似的同源基因。下一步實(shí)驗(yàn)需要繼續(xù)深入研究基因aurJ3M的功能，研究金褐霉素的生物合成機(jī)制，為通過(guò)基因改造進(jìn)行金褐霉素組合生物學(xué)研究、結(jié)構(gòu)的修飾改造和產(chǎn)量提高提供科學(xué)依據(jù)，為最終開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的四烯類生物防腐劑奠定基礎(chǔ)，也對(duì)豐富我國(guó)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素資源庫(kù)具有重要意義。

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Screening and Expression of Regulatory Gene for Enhanced Aureofuscin Production

WEI Jie, SONG Wei, SHI Jia
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Aims: To our knowle dge, the production of aureofuscin is very low in the wild-type strain of Streptomyces aureofuscus (S. aureofuscus). This study attempted to increase the production of aureofuscin by over-expression of a regulatory gene in the wild-type strain. Methods and Results: The aurj3M gene was amplified by PCR from S. aureofuscus SYAU0709, ligated into the vector pMD19, and sequenced. Recombinant bacterial strains were constructed by transforming SYAU0709 with an expression plasmid (pBJAUM) that contained aurj3M, thereby increasing the number of aurj3M gene copies. Conclusions: The fermentation results showed aurJ3M gene could promote aureofuscin production. Specifically, the recombinant strain produced approximately 600% more aureofuscin, as quantified by high-performance liquid chromatography analysis. The recombinant strain also had good genetic stability.

Streptomyces aureofuscus; aureofuscin; aurj3M gene; fermentation

Q78

A

1002-6630（2014）09-0203-04

10.7506/spkx1002-6630-201409040

2013-11-06

遼寧省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（L2011008）

魏杰（1977—），女，副教授，博士，主要從事食品科學(xué)、微生物工程研究。E-mail：weijie@lnu.edu.cn