朱運(yùn)明，王曉飛，閔偉紅，詹冬玲，王隆洋

北京棒桿菌天冬氨酸激酶G377定點(diǎn)突變及酶學(xué)性質(zhì)表征

朱運(yùn)明，王曉飛，閔偉紅*，詹冬玲，王隆洋

（小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

采用飽和定點(diǎn)突變和高通量篩選技術(shù)，對(duì)北京棒桿菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）AK Gly377位點(diǎn)進(jìn)行突變，并篩選獲得高活力突變體G377F，分離純化后對(duì)G377F AK酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。結(jié)果表明：突變體AK最適pH值為9.0，較突變前野生型（wide type，WT）最適pH值為8.5有所提高；最適反應(yīng)溫度與WT一致，均為25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；pH耐受性在5 h內(nèi)保持其活力50%以上，與WT 3 h內(nèi)酶活力保持能力相同。G377F對(duì)金屬離子和有機(jī)溶劑均表現(xiàn)出良好的抗性。其中，Lys的抑制作用在一定程度上被解除，當(dāng)Lys和Met同時(shí)存在時(shí)對(duì)AK具有明顯的激活作用。動(dòng)力學(xué)研究顯示：G377F AK Vmax較WT提高9.3 倍；n值為1.0明顯低于WT的2.7，說明AK正協(xié)同性降低，趨向于米氏酶。

北京棒桿菌；天冬氨酸激酶；定點(diǎn)突變；酶學(xué)性質(zhì)

天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）廣泛存在于植物、細(xì)菌和真菌中，是生物合成蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸的關(guān)鍵酶之一[1-4]。植物中大部分含有3 種單功能酶AKS（AKⅠ、AKⅡ和AKⅢ）和2種雙功能酶AK-高絲氨酸脫氫酶（AKⅠ-HSDHⅠ和AKⅡ-HSDHⅡ）[5-7]。來自大腸桿菌中的AKⅠ和AKⅢ分別受蘇氨酸、賴氨酸和亮氨酸的反饋抑制[8]，而來自谷氨酸棒桿菌中的AK受賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同抑制[9-10]。因此，為使代謝產(chǎn)物過量積累，提高AK催化活力，解除其代謝產(chǎn)物的抑制作用對(duì)氨基酸的合成至關(guān)重要。

谷氨酸棒桿菌中AK是α2β2四聚體結(jié)構(gòu)[11-13]。α亞基包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N末端的催化結(jié)構(gòu)域和C末端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，且α亞基和β亞基的C末端區(qū)域功能相同，由兩個(gè)ACT區(qū)域組成（ACT1，ACT2），以βαββαβ折疊結(jié)構(gòu)形式存在[14]。在每個(gè)αβ調(diào)節(jié)區(qū)中都含有兩個(gè)蘇氨酸分子和一個(gè)賴氨酸分子。其中，賴氨酸存在于由β亞基ACT1和α亞基ACT2構(gòu)成的位點(diǎn)處，其羧基通過氫鍵與Ile44（β）-N、Val360（α）-N、Thr361（α）-N和Thr361（α）-O?1相連，并與Gly359-N和Ile42-O通過兩個(gè)水分子形成氫鍵，最終賴氨酸通過所形成的鍵橋水分子進(jìn)一步穩(wěn)定[15]。因此，Gly359位點(diǎn)具有穩(wěn)定配體Lys與A K結(jié)合的作用，從而加強(qiáng)了Lys對(duì)AK的反饋抑制。我們推測(cè)，將該位點(diǎn)改變以期打破其與Lys間的非共價(jià)鍵作用，從而解除賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制。

由于北京棒桿菌中AK晶體結(jié)構(gòu)未報(bào)道，而該菌中AK與谷氨酸棒桿菌中AK序列同源性高達(dá)99%，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇谷氨酸棒桿菌中AK晶體結(jié)構(gòu)（3aaw，PDB）[16]為模板對(duì)北京棒桿菌中AK進(jìn)行研究。通過結(jié)構(gòu)分析，谷氨酸棒桿菌Gly359和Lys601氨基酸位點(diǎn)（圖1）分別對(duì)應(yīng)于北京棒桿菌中Gly377和Lys619。在北京棒桿菌AK基因與載體pET-28a實(shí)現(xiàn)重組的基礎(chǔ)上，運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)AK基因Gly377進(jìn)行飽和定點(diǎn)突變，探討北京棒桿菌中AK基因序列Lys619與Gly377位點(diǎn)間的非共價(jià)鍵作用對(duì)AK活力的影響，為天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的構(gòu)建提供參考。

圖1 谷氨酸棒桿菌中Gly359與Lys601非共價(jià)鍵作用圖Fig.1 The non-covalent bond interaction between Gly359 and Lys601 in Corynebacterium glutamicum

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

大腸桿菌E. coli BL21（DE3）和北京棒桿菌 本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒pET28a-AK 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[17]。丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、Tris、過硫酸銨、硫酸卡那霉素和β-巰基乙醇 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；PVDF膜 中國Bio-Rad公司；PCR試劑盒、定點(diǎn)突變?cè)噭┖小pnI消化酶和質(zhì)粒提取試劑盒、PCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；ATP 日本MYM生物技術(shù)有限公司；非變性鎳柱及柱料 美國GE公司；HRP Mouse Anti-6×His 美國BD PharmingenTM公司；DNA Marker 日本TaKaRa公司；DAB顯色試劑 中國Maixin_Bio公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳試劑的配制參照文獻(xiàn)[18]。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基，按照文獻(xiàn)[19]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1700紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；Scientz-ⅡD超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；SE260垂直電泳儀 美國Amersham Biosciences公司；Jin-x水平瓊脂糖凝膠電泳槽 大連競(jìng)賣生物科技有限公司；Eppendorf AG PCR儀 德國Eppendorf公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司；InfinitieM200酶標(biāo)儀瑞士Tecan公司；Trans-Blot SDCell蛋白印跡轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；TG-16W臺(tái)式微量高速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；Sartorius BSA224S分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飽和定點(diǎn)突變及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)北京棒桿菌Corynebacterium pekinense中AK基因序列設(shè)計(jì)高通量突變引物，上游引物 5’-CTTCCATG AACTCTGCGGTAACNNNTGGGGTGAGACTG-3’；下游引物5’- GCATGCAGTCTCACCCCANNNGTTACCGC AGAG-3’。下劃線為突變位點(diǎn)。定點(diǎn)突變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）以pET-28a-AK為模板，在上述引物作用下擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 34 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，模板DNA 2 μL，引物各2 μL， LA Taq 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸10 min，循環(huán)18 次；72 ℃、20 min。PCR產(chǎn)物用DpnⅠ酶消化除去模板后直接轉(zhuǎn)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化成功單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中活化并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序引物如下：上游引物5’-GGAATTCCATATGGCCCTGGTCGT ACAGAA-3’；下游引物5’-GGAATTCTTAGCGTCCGGT GCCTGCAT-3’。

1.3.2 AK基因驗(yàn)證、誘導(dǎo)表達(dá)、酶液制備及純化

基因驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系：ddH2O 36 ?L，10×PCR Buffer 5 ?L，dNTP 4 ?L，引物各1 ?L；模板3 ?L；Taq 0.25 ?L。該反應(yīng)以突變成功的pET-28a-AK為模板，引物為上述測(cè)序引物。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃、40 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次；72 ℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

經(jīng)測(cè)序檢測(cè)AK Gly377發(fā)生突變的菌株再次活化，并將其種子菌液按照2%接種量轉(zhuǎn)移到500 mL（含250 mL培養(yǎng)基）搖瓶中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)，待菌體濃度OD600nm值0.6～0.8時(shí)，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)劑（終濃度為1 mmol/L）誘導(dǎo)發(fā)酵8 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min去上清液，收集菌體，pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）重懸，PBS體積與菌體質(zhì)量為7∶1。充分混勻后，冰浴超聲波破碎后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min得到上清液，過0.45 μm膜即為粗酶液。用非變性鎳柱對(duì)酶液進(jìn)行純化。先后用20 mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑15 mL、70 mmol/L咪唑10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL以及200 mmol/L咪唑3 mL洗脫除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，用500 mmol/L咪唑10 mL洗脫得到純化后AK蛋白。

1.3.3 AK酶活力測(cè)定

利用吸光光度法通過檢測(cè)天冬氨酸異羥肟酸A540nm值改變來測(cè)定天冬氨酸激酶酶活力[20-21]。200 μL反應(yīng)體系中含800 mmol/L KCl、10 mmol/ L-Asp、94 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10.4 mmol/L ATP、16 mmol/L MgSO4、10 mmol/L β-巰基乙醇、800 mmol/L NH3·H2O、10 μL酶液，在28 ℃、120 r/min條件下反應(yīng)30 min；試管5 mL反應(yīng)體系組成同200 μL反應(yīng)體系，100 μL酶液，在26 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，均加入等體積FeCl3終止試劑。以不加底物的反應(yīng)體系A(chǔ)540nm值作為對(duì)照，所測(cè)的A540nm即為天冬氨酸異羥肟酸離子的光學(xué)密度。反應(yīng)速率V定義為單位時(shí)間（1 min）內(nèi)單位質(zhì)量（1 mg）酶的催化能力，單位表示為U/（mg·min）。酶活力U表示為1 000×A540nm值，純化后AK蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 SDS-PAGE和Western blotting法檢測(cè)

純化后AK蛋白采用SDS-PAGE驗(yàn)證；將含有目的蛋白AK的SDS-PAGE切下，15 V穩(wěn)壓電轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜上，2%～5%脫脂奶粉封閉，經(jīng)HRP Mouse Anti-6×His（用TBS按1∶2 500稀釋）孵化2 h，DAB顯色7～10 min。

1.3.5 AK動(dòng)力學(xué)研究

動(dòng)力學(xué)分析方法是在其他試劑和條件不變的前提下，底物L(fēng)-天冬氨酸濃度分別為0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mmol/L，測(cè)定AK活力，每個(gè)濃度均做3 個(gè)平行，利用Origin7.5軟件，以Hill方程進(jìn)行非線性擬合。

1.3.6 最適反應(yīng)溫度及最適pH值的研究

最適反應(yīng)溫度：以天冬氨酸為底物，其他酶活力測(cè)定條件不變，測(cè)定不同反應(yīng)溫度（15、20、25、28、 30、35、40、45、50 ℃）下AK活力，每組樣品檢測(cè)3 個(gè)平行。

最適反應(yīng)pH值：溫度設(shè)為最適溫度，其他酶活力測(cè)定條件不變，測(cè)定不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）94 mmol/L Tris-HCl緩沖液下AK酶活力，每組樣品檢測(cè)3 個(gè)平行。

1.3.7 AK熱穩(wěn)定性和pH值耐受性研究

將AK于最適反應(yīng)溫度和最適pH值條件下保溫，每隔1 h測(cè)定其酶活力，將0 h條件下相對(duì)酶活力定義為100%，每組3 個(gè)平行。

1.3.8 金屬離子與有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的研究

在酶反應(yīng)體系考察不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）的不同種類金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+）對(duì)AK酶活力的影響，以不添加金屬離子的相對(duì)酶活力定義為100%?？疾旒状?、乙醇、丙三醇、異丙醇、乙腈、正丁醇、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響，每種溶劑體積分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%、20%，以不添加有機(jī)溶劑的相對(duì)酶活力定義為100%，以上每組均做3 個(gè)平行。

1.3.9 底物抑制劑對(duì)AK活力的影響

考察不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）抑制劑（L-methionine、L-lysine、L-threonine）對(duì)AK活力的影響，以未添加底物抑制劑的相對(duì)酶活力定義為100%，每組樣品3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建、SDS-PAGE及Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖2 AK基因PCR擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 1% Agarose electrophoresis of PCR amplification products of AK gene

突變后經(jīng)篩選獲得12 株突變株，結(jié)合測(cè)序結(jié)果選擇AK酶活力較高有代表性菌株4 株，4 株突變株AK氨基酸序列中377 位點(diǎn)由野生型Gly分別突變成Asp、Phe、Tyr和Lys。將上述4 種突變體重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對(duì)其雙酶切和核酸電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，分子質(zhì)量在1 000～2 000 bp存在目的單帶，這與AK基因分子質(zhì)量為1 453 bp相符，表明突變體構(gòu)建成功。

圖3 10% SDS-PAGE蛋白電泳圖和Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.3 10% SDS-PAGE and Western blotting analysis

將非變性鎳柱處理得到的AK純化酶液經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳和Western blotting驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。野生型粗酶液、野生型純化液以及突變體純化液在分子質(zhì)量為48 kD左右均存在目的帶，表明AK基因大量表達(dá)。由泳道2～6可看出，泳道2中目的條帶明顯比突變體目的帶粗，表明突變后AK基因的表達(dá)量較野生型低。

2.2 突變體的動(dòng)力學(xué)分析

表1 WT和突變體動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of WT and mutant strains

注：n代表AK中亞基數(shù)，AK是四聚體結(jié)構(gòu)，其n值在4以內(nèi)。如果n=1，說明為米氏酶；如果n不等于1，說明為別構(gòu)酶；當(dāng)n＞1時(shí)，表明酶具有正協(xié)同性，n值越大正協(xié)同性越高；n＜1，為酶具有負(fù)協(xié)同性；如果n值接近1，表明趨于米氏酶。

如表1所示，G377D、G377F、G377Y、G377K的Vmax分別為9.8、33.9、25.2、27.4 U/（mg·min），較野生型（wide type，WT）菌株（3.3 U/（mg·min））分別提高了2.0、9.3、6.6、7.3 倍；n值均明顯低于WT，表明經(jīng)突變后AK的正協(xié)同性降低。這可能是377 位點(diǎn)Gly由極性不帶電荷分別改變?yōu)锳sp極性帶負(fù)電荷、Phe非極性（疏水）、Tyr極性帶正電荷和Lys極性不帶電荷，在一定程度上破壞了與抑制劑Lys間的非共價(jià)鍵作用，使亞基間聚合度降低，結(jié)構(gòu)松散，導(dǎo)致抑制劑Lys結(jié)合位點(diǎn)由致密組織變得松散不穩(wěn)定，不利于抑制劑的結(jié)合。突變體由別構(gòu)酶趨向米氏酶，Vmax提高。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)酶活力提高最大突變株G377F進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.3 G377F酶學(xué)性質(zhì)表征

2.3.1 最適溫度和最適pH值對(duì)AK活力的影響

圖4 不同pH值（a）和溫度（b）對(duì)G377F AK活力的影響Fig.4 Effects of pH (a) and temperature (b) on the activity of AK from G377F

由圖4a可知，G377F最適反應(yīng)pH值為9.0，較WT pH 8.5有提高。當(dāng)pH值在6～9變化時(shí)，隨pH值升高，G377F中AK活力呈增大趨勢(shì)；當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，AK活力急劇下降。由圖4b可知，G377F中AK最佳反應(yīng)溫度為25 ℃，與WT相同，當(dāng)溫度在15～25 ℃范圍內(nèi)升高時(shí)，G377F AK活力呈現(xiàn)較大升高趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度高于25 ℃時(shí)，G377F AK活力呈顯著下降，溫度升高至50 ℃時(shí)，酶活力降低80%，與WT相比G377F AK耐高溫能力下降。

2.3.2 AK的熱穩(wěn)定性和pH值耐受性研究

圖5 WT和G377F中AK的熱穩(wěn)定性和pH值耐受性Fig.5 Stability and pH tolerance of AK from WT and G377F

由圖5可知，G377F中AK在最適反應(yīng)溫度25 ℃條件下具有較好的穩(wěn)定性，其半衰期為5.3 h，比WT半衰期2.6 h高，這可能是突變體酶亞基間的聚合度加強(qiáng)，因而熱穩(wěn)定性加強(qiáng)。G377F中AK在最適pH 9.0條件下，其pH值耐受性在5 h內(nèi)能保持其活力在50%以上，與WT 3 h內(nèi)酶活力保持能力相同，10 h后兩者活力均下降80%左右。2.3.3 金屬離子對(duì)AK活力的影響

表2 金屬離子對(duì)WT和G377F中AK活力的影響Table 2 Effect of metal ions on the enzyme activity of AK from WT and G377F

表2為金屬離子對(duì)WT和G377Y中AK活力的影響。對(duì)G377F分析可知，Na+和Mg2+對(duì)酶活力基本無激活作用（除了Mg2+在0.2 mmol/L時(shí)有一定激活作用），而是表現(xiàn)出一定的抑制作用。K+在低濃度時(shí)對(duì)酶有激活作用，但隨著濃度的增加顯示出抑制作用。Ca2+在濃度0.2～10 mmol/L時(shí)對(duì)G377F都有激活作用，而對(duì)WT卻一直呈現(xiàn)抑制作用。當(dāng)Mn2+、Cu2+和Fe3+濃度為0.2 mmol/L時(shí)，G377F相對(duì)酶活分別為192.88%、193.07%和186.99%，而隨著濃度增加表現(xiàn)抑制作用。Ni2+抑制作用更加明顯，當(dāng)濃度為5 mmol/L時(shí)，G377F檢測(cè)不到酶活力。

2.3.4 有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的影響

表3 有機(jī)溶劑對(duì)WT和G377F中AK活力的影響Table 3 Effect of organic solvents on the enzyme activity of AK from WT and G377F

由表3可知，所有有機(jī)溶劑對(duì)WT AK活力顯示明顯的抑制作用，而對(duì)G377F AK在低體積分?jǐn)?shù)時(shí)均表現(xiàn)激活作用，隨著體積分?jǐn)?shù)的增加都表現(xiàn)出抑制作用，說明G377F對(duì)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出明顯的抗性。

2.3.5 底物抑制劑對(duì)AK活力的影響

表4為不同抑制劑組合對(duì)AK活力的影響，對(duì)比WT發(fā)現(xiàn)，低濃度（0.2 mmol/L）賴氨酸和蛋氨酸表現(xiàn)出對(duì)G377F激活作用，隨著濃度的升高，這種積極作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔谩６嚢彼幔鞍彼嶂挥性诟邼舛龋?0 mmol/L）時(shí)，對(duì)AK呈現(xiàn)出抑制作用，其他濃度均為激活作用。除Thr＋Lys在1 mmol/L時(shí)有激活作用外，其他含有蘇氨酸的抑制劑均表現(xiàn)出對(duì)AK的抑制作用，說明突變后主要解除了賴氨酸對(duì)AK的部分抑制，這與本研究目的相符。

表4 底物抑制劑對(duì)WT和G377F中AK活力的影響Table 4 Effect of substrate inhibitors on the enzyme activity of AK from WT and G377F

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)北京棒桿菌中AK基因Gly377位點(diǎn)進(jìn)行飽和定點(diǎn)突變，以達(dá)到解除與抑制劑Lys間的非共價(jià)鍵作用并提高酶活力的目的。運(yùn)用軟件Primer Premier5設(shè)計(jì)突變引物，以連接了北京棒桿菌中AK基因的重組質(zhì)粒pET-28a-AK為模板進(jìn)行突變，通過高通量成功篩選出G377F。并對(duì)G377F AK進(jìn)行純化、10% SDS-PAGE和Western blotting驗(yàn)證。結(jié)果表明：突變體G377F和WT AK分子質(zhì)量均為48 kD，G377F AK Vmax較WT提高了9.3 倍，且正協(xié)同性降低。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，G377F AK最適pH值為9.0，最適反應(yīng)溫度25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；G377F pH值耐受性在5 h內(nèi)保持其酶活力50%以上，與WT 3 h內(nèi)酶活力保持能力相同。同時(shí)，G377F對(duì)金屬離子和有機(jī)溶劑均表現(xiàn)出良好的抗性，部分解除底物抑制劑Lys和Lys＋Met對(duì)AK酶活力的抑制作用。

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Site-Directed Mutagenesis and Characterization of Aspartate Kinase G377 from Corynebacterium pekinense

ZHU Yun-ming, WANG Xiao-fei, MIN Wei-hong*, ZHAN Dong-ling, WANG Long-yang
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Aspartate kinase (AK) is the first critical enzyme in the biosynthesis pathw ay of vital amino acids, in which AK is strictly regulated by metabolites. In the present study, AK from Corynebacterium pekinense was mutated using sitedirected mutagenesis combined with high-throughput screening and G377F with high activity was successfully constructed. Then, the purified AK from G377F was characterized. The results showed that the optimum reaction pH of G377F was 9.0, which was slightly higher than that of the wild-type strain (WT). The optimum reaction temperature of G377F was 25 ℃, which was consistent with that of WT. The half-life period of G377F increased from 2.6 h (WT) to 5.3 h. The pH tolerance of G377F maintained more tha n 50% of its original vitality in 5 h, which was identical to that of WT (3 h). In addition, AK from G377F had a good tolerance to metal ions and organic solvents. To some extent, the inhibition by Lys could be released and the co-presence of Lys and Met had an active effect on the G377F. Kinetic studies showed that the Vmaxof AK from G377F was 10.3 times higher than that of WT. The n value was 1.0, which was significantly lower than that of WT, indicating that the positive cooperativity of AK from G377F decreased, which showed that AK from G377F tended to be a Mich aelis enzyme.

Corynebacterium pekinense E31; aspartate kinase; site-directed mutagenesis; enzymatic activity

Q814.9

A

1002-6630（2014）09-0192-06

10.7506/spkx1002-6630-201409038

2013-10-29

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20130101139JC）

朱運(yùn)明（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵微生物的選育與代謝調(diào)控。E-mail：zhuming.1988.happy@163.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、糧食科學(xué)與深加工技術(shù)。E-mail：minwh2000@163.com